玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定

以玉米皮为唯一碳源培养裂褶菌,分别测定发酵液中半纤维素酶活性,结果显示木聚糖酶酶活为7.45U/mL、乙酰木聚糖酯酶酶活为3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶活相对较低,分别为0.44 U/mL和0.074 U/mL。根据酶活测定结果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22,完成了该基因在大肠杆菌中的表达、重组蛋白纯化和性质研究。Xyn22的最适反应温度为40℃,当反应温度在45℃时其相对酶活在80%以上。Xyn22的最适pH为5.0,在4.5~6.5的范围内酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0~10.5范围内较稳定,酶活保持在80%左右。Mg~(2+)、Ba~(2+)、EDTA和Hg~(2+)对酶活有很大的抑制作用,Hg~(2+)可以使Xyn22几乎完全失活。     

N-端二硫键及芳香族氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

为提高GH11家族中温木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性,将其N-端替换成GH11家族的耐热性木聚糖酶Ev Xyn11的相应序列,并在该段序列引入芳香族氨基酸残基(P9Y、H14F),构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34,将木聚糖酶基因xyn ZF-2和xyn EV-34分别在E.coli BL21中表达,并分析温度和p H对酶活性的影响。结果表明,杂合木聚糖酶Xyn EV-34的最适温度为48℃,相比原酶Xyn ZF-2提高了8℃。在40℃保温1 h,原酶Xyn ZF-2残余酶活性下降到44.36%,而突变酶Xyn34残余酶活性为77.96%。在45℃,突变酶Xyn EV-34的半衰期t1/245℃为23 min,较重组酶Xyn ZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同时,两种酶的最适p H均为5.0,但p H稳定性由原来的4.4~9.0扩增到了3.0~9.0。由此表明,二硫键以及芳香族氨基酸的引入,对该酶的热稳定性以及p H稳定性都有明显改善。     

木聚糖酶基因XynB在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

目的:将来源于Thermotoga maritima的酸性耐高温木聚糖酶基因Xyn B通过密码子优化整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高效表达木聚糖酶Xyn B的毕赤酵母工程菌并研究其酶学性质。方法:通过分子克隆手段构建目的基因重组质粒以及二拷贝重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母进行发酵表达,用DNS法测定发酵液酶活,并对酵母工程菌分泌的木聚糖酶进行一系列的酶学性质研究。结果:木聚糖酶的最适p H和温度分别为6.0和60℃;在p H4~6之间,稳定性较好,相对比酶活均在80%以上;在60℃和70℃保温2 h残留酶活分别为80%和70%左右;Co~(2+)对木聚糖酶活性有较明显的促进作用,Fe~(2+)、K~+和Zn~(2+)对酶的活性有微弱的促进作用,而Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对木聚糖酶活性有不同程度的抑制作用。TLC检验该木聚糖酶可以将木聚糖水解为二糖和少量单糖。通过10 L发酵罐发酵,最大酶活达到了8000 U/m L。结论:木聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达,并获得了木聚糖酶的最适反应条件等一系列酶学性质,该酶性质优良适合用于饲料添加剂。     

S179C突变提高宇佐美曲霉木聚糖酶(XynII)热稳定性的研究

宇佐美曲霉木聚糖酶（XynⅡ）是G／11族高比活木聚糖酶的一种,通过S179C定点突变,发现酶最适反应温度由原来的50℃提高到52℃;50℃热处理,半衰期由原酶的23min延长到突变后酶的70min,热稳定性提高到原来的3倍;最适反应pH无变化。     

引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响

生物信息学预测黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,并在α-螺旋处引入疏水性氨基酸以提高木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性。通过定点突变活性位点E103D、E194D,构建突变基因xyn ED。同时,将α-螺旋处氨基酸Val125、Lys178和Gly180分别突变为疏水性氨基酸Ala、Met和Ala,构建突变基因xyn MA。突变基因xyn ED和xyn MA在大肠杆菌BL21中表达发现,突变酶Xyn ED酶活性为原酶Xyn ZF-2的0.17%;突变酶Xyn MA最适温度由原来的40℃提高到了48℃;在40℃条件下保温1 h,突变酶Xyn MA酶活性仍高达74.71%(原酶Xyn ZF-2为44.36%);突变酶Xyn MA的半衰期t45℃1/2从原来的7 min提高到了19 min。因此,Glu103和Glu194为木聚糖酶Xyn ZF-2的催化活性中心位点,且在木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋处引入疏水性氨基酸能大大提高其热稳定性。     

碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

V1C定点突变木聚糖酶XynZF-2对酶热稳定性的影响

对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中温木聚糖酶Xyn ZF-2进行热稳定性改造,定点突变v1c,构建重组突变酶Xyn ZF-2V1C。重组原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并进行酶学性质分析。结果发现,突变酶Xyn ZF-2V1C最适温度为50℃,相比原酶Xyn ZF-2最适温度提高了10℃;在45℃条件下的半衰期t45℃1/2,突变酶Xyn ZF-2V1C相对于原酶Xyn ZF-2提高了10 min;原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C最适p H均为5.0,p H稳定范围均为5.0~9.0,基本没有变化;原酶Xyn ZF-2和突变酶Xyn ZF-2V1C的Km分别9.96 mg/m L和12.4 mg/m L,Vmax分别为74.63 U/mg和90.91 U/mg。     

双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究

木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域DockerinΙ。在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶。将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与p H值分别为60℃、6. 0,且在60℃以下或p H 4. 5～10. 5的范围内有较好的稳定性。水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖。     

二硫键对提高木聚糖酶AoXyn11A热稳定性的作用

为提高米曲霉11家族中温木聚糖酶Ao Xyn11A的热稳定性,将Ao Xyn11A与源于Thermomyces lanuginosus的耐热木聚糖酶Xyn A进行三维结构比对分析,发现Xyn A的α-螺旋与β9-折叠之间存在一个二硫键;基于分子动力学模拟预测结果,利用定点突变技术在Ao Xyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152),获得突变酶Ao Xyn11AT;分别将Ao Xyn11A及其突变酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化,获得重组Ao Xyn11A和Ao Xyn11AT,并分析比较温度对其酶活性的影响。结果显示,重组Ao Xyn11AT的最适温度为60℃,比重组Ao Xyn11A提高了5℃;其在50℃下的半衰期t1/250为71 min,较重组Ao Xyn11A(t1/250=25 min)提高了近2倍。研究表明二硫键对提高Ao Xyn11A的热稳定性有重要作用。     

引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。     

碱性木聚糖酶产生菌株的分离鉴定与产酶分析

目的：分离1?株高产碱性木聚糖酶菌株。方法：以木聚糖为唯一碳源,从造纸厂活性污泥中筛选1?株高产碱性木聚糖酶细菌,采用3,5-二硝基水杨酸法定糖法测定菌株产木聚糖酶的活力,并通过生理、生化特征以及16S?rRNA基因序列分析比对对菌株进行鉴定。结果：菌株YD01所产木聚糖酶的最适pH值为8.0,最适温度为50?℃;在pH?10和80?℃时,仍有87%和85%的剩余酶活力,具有较好的耐碱性及较高的热稳定性。最终发酵产酶水平为36.85?U/mL。结论：鉴定该菌株为蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）,所产生的木聚糖酶具有较高的碱耐受性和热稳定性。     

木聚糖酶产生菌的筛选、发酵及酶学性质

该研究对木论自然保护区土壤中高产木聚糖酶的菌株进行了分离,经菌落形态观察、ITS基因序列分析对菌株进行了鉴定,并通过单因素固态发酵实验确定最佳产酶条件。结果表明,筛选到1株高产木聚糖酶菌株,并鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。其最佳产酶培养基配方：玉米芯与麸皮质量比为1∶7、氮源为硫酸铵（添加量1.4 g/L）、初始pH值为5.0、料水比为1∶3.5（g∶mL）,接种量为7.5%。在此优化条件下,木聚糖酶酶活最高可达10 801.3 IU/g。酶学性质研究表明,木聚糖酶的最适作用pH值为5.5、最适作用温度为37 ℃。     

毛壳霉木聚糖酶B（CsXyn11B）的分泌表达及其在面包中的应用

目的:对毛壳霉（Chaetomium sp.）CQ31木聚糖酶B（CsXyn11B）进行分泌表达,以提高产酶水平并探究在面包烘焙中的应用价值。方法:将木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达,高密度发酵提高其产酶水平,对酶学性质进行表征并将其应用在面包烘焙中。结果:重组菌经高密度发酵156 h,木聚糖酶酶活力为2788 U/mL。CsXyn11B最适pH为8.0,最适温度为65 ℃。CsXyn11B能够水解多种木聚糖底物,对燕麦木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖的比酶活分别为1145.8、1041.7、692.3和653.3 U/mg。该酶水解阿拉伯木聚糖,水解产物以聚合度4~6的低聚木糖为主。在面包制作过程中加入3 mg/kg CsXyn11B使面包比容增加15.9%,面包硬度降低25.3%,4 ℃贮藏2 d后硬度比对照组降低17%。结论:毛壳霉木聚糖酶B的优良酶学特性使其在烘焙食品中具有良好的应用前景。     

木聚糖酶产生菌Gh-5培养基配方及发酵条件的优化

研究培养基组分与发酵工艺条件对试验菌株Gh-5产木聚糖酶的发酵影响,并对木聚糖酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,该菌最适发酵产酶培养基组分为甘露糖15 g/L,氯化铵10 g/L,ZnSO4 0.3 g/L,KH2PO4 0.5 g/L;最适发酵条件为温度37 ℃;pH值为8.0;接种量14 %;发酵培养生长周期36 h。木聚糖酶产生菌株Gh-5发酵优化后的酶活力为114.64 U/mL,较优化前38.02 U/mL提高了201.53%。木聚糖酶酶学性质研究结果表明,木聚糖酶酶活最适pH值为8.0;最适温度为65 ℃;Zn2+对木聚糖酶酶活有较好促进作用。     

啤酒小麦木聚糖酶酶学性质的研究

通过DNS法测定小麦木聚糖酶酶促反应的最适条件。结果表明:小麦木聚糖酶酶促反应的最适温度是50℃,最适pH是5.5~6.0,最适底物浓度是1.0000%,最适底物与酶液用量比例为9/1,最适反应时间为5-9min。     

酸性木聚糖酶固态发酵条件与粗酶性质研究

利用单因素和正交试验对实验室选育的黑曲霉XZ-3S(Aspergillus niger XZ-3S)菌株的发酵条件进行了研究.得到试验因素的产酶条件为天然原料麸皮与玉米芯的比例为5∶3,接种量1.0％(孢子悬液,孢子浓度5×107个/mL),料水比例1∶1.7,培养基初始pH值为7.5,培养温度28℃、培养时间65h,其间翻曲2～3次,在上述条件下木聚糖酶的活力可达23612.38IU/g干曲.酶学性质初步研究显示,酶的最适反应温度和pH值分别为50℃和5.0,低于50℃、pH3.0～8.0酶稳定.     

N-糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响

为实现木聚糖酶的高效表达,扩大实际生产应用,本实验将木聚糖酶基因xynA在毕赤酵母中进行重组表达,同时采用糖基化抑制剂衣霉素处理毕赤酵母细胞,以此来探讨N-糖基化对木聚糖酶XynA酶学性质的影响。结果表明,SDS-PAGE电泳图谱显示木聚糖酶XynA发生了N-糖基化修饰,分子量约为45 kDa,酶活为406.6 U/mL,最适pH及反应温度分别为5.0和65 ℃;而添加不同浓度衣霉素处理后的木聚糖酶最适pH不变,最适反应温度下降5 ℃,随着衣霉素浓度的增加,去糖基化的木聚糖酶酶活力、分泌量及温度稳定性均有所下降,且当衣霉素添加浓度为15 μg/mL时,剩余酶活为53.6%。去糖基化的木聚糖酶耐受胃蛋白酶的能力较糖基化的有所增强,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA相对于糖基化的木聚糖酶表现出了一定的激活作用。以上结果说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰对木聚糖酶XynA的分泌及热稳定性有促进作用。     

黑曲霉M_1菌株木聚糖酶复合酶的固态发酵条件及其酶学性质研究

以玉米芯和麸皮 ( 7∶3 )为碳源 ,(NH4) 2 SO4( 2 % )为氮源 ,3 0℃培养 72h ,发酵曲用蒸馏水3 0℃浸提 1h ,得到 β 1,4 木聚糖酶活力高 ,β 木糖苷酶活力低的粗酶液。β 1,4 木聚糖酶和 β 木糖苷酶的最适作用温度分别为 5 0℃和 60℃ ,最适作用pH分别为 4 8和 4 0 ,β 1,4 木聚糖酶在pH5 0～ 10 6范围内稳定 ,β 木糖苷酶在 pH 3 0～ 3 0范围内稳定。β 木糖苷酶的热稳定性比 β 1,4 木聚糖酶高     

壳聚糖—戊二醛固定化木聚糖酶的技术研究

采用壳聚糖微球一戊二醛交联的方法固定木聚糖酶,探讨壳聚糖浓度、戊二醛体积分数和交联时间对固定化酶相对酶活力的影响.以正交试验确定木聚糖酶的最佳固定化条件,比较固定化酶与其游离酶的最适反应pH值、pH值稳定性、最适反应温度及热稳定性.结果表明,在壳聚糖质量浓度0.1g/mL、戊二醛添加量3％、给酶量2000U/g载体、交联时间2.5h时,固定化酶的回收率较高,可达到65.38％,同时固定化和游离酶的最适温度分别为60℃、55℃,最适pH值分别为4.5、5.0,热稳定性有不同程度的提高,pH稳定性两者变化不大.木聚糖酶的固定化能有效地提高其作用性能,从而为木聚糖酶的工业化应用提供了一定的理论依据.     

产木聚糖酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

以木聚糖为唯一碳源,采用平板筛选和摇瓶发酵相结合的方法,从腐朽木头中分离、筛选到一株高产木聚糖酶菌株XE-13-1,根据菌株的形态特征,并结合18S rDNA序列分析,初步鉴定菌株XE-13-1为桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）。经测定,菌株XE-13-1所产木聚糖酶的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值7,具有较好的pH稳定性。在30 ℃、pH 5～10的条件下保温2 h,该酶仍具有78%以上的酶活力。Mg2+、Fe2+、K+、Zn2+对该酶具有明显的促进作用,Cu2+对该酶具有明显的抑制作用。酶学性质研究结果表明,该酶在工业应用上具有较好的前景。