产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株,但是在2,3-丁二醇(2,3-BD)的发酵过程中,会积累较多的副产物乙偶姻(AC)。乙偶姻还原酶是催化AC合成2,3-BD的关键酶。为了提高2,3-BD合成效率,首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到B.subtilis 168,构建了重组菌B.subtilis 168/p MA5-acr。对重组菌进行摇瓶发酵实验,结果表明,相比出发菌,重组菌的2,3-BD产量和转化率分别提高28.62%和22.87%,主要副产物AC积累量下降了20.01%。同时,分支路径的副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸,也有不同程度的降低。     

一株芽孢表面稳定展示海藻糖合酶工程菌的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因组为模板,PCR扩增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,重叠PCR连接sleB1与卡那霉素抗性(kmr )基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleB菌株;连接cwlJ1与博来霉素抗性(zeor)基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。结果表明,经kmr、zeor抗性筛选及PCR鉴定,成功获得sleB、cwlJ基因双缺失菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ;发酵结果显示,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ与出发菌株的芽孢形成率一致,约为88%;在LB固体培养基和麦芽糖转化生成海藻糖体系中B. subtilis 168-Tres的芽孢萌发数为4.8×108 CFU/mL,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,重组菌海藻糖合酶酶活为10.42 U,比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后,不影响枯草芽孢杆菌生成芽孢的量,但能有效控制芽孢在上述转化体系中的萌发,使芽孢表面稳定展示海藻糖合酶,提高了芽孢的利用率。     

无痕敲除法构建食品安全级枯草芽孢杆菌无芽孢菌株

利用同源重组法快速构建枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis168)spo0A基因缺陷型无芽孢菌株B.subtilis168Δspo0A。经PCR及核酸电泳验证,孢子形成率鉴定和芽孢染色镜检,确定最终获得不产芽孢的B.subtilis168Δspo0A基因缺失突变菌株。基因敲除完成后,菌株基因组不需引入抗性基因或其它任何筛选标记,实现了对spo0A基因的无痕基因敲除。本研究对枯草杆菌的工业化生产及提高相关产品食品质量安全性具有重要意义。     

脱乙酰基酶在枯草芽孢杆菌中的高效可溶性表达

为提高脱乙酰基酶的可溶性表达含量,对前期挖掘的脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因进行异源表达及发酵优化。将脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p P43NMK的npr B信号肽下游,转入B.subtilis WB800构建了重组工程菌B. subtilis WB800/p P43NMK/nap-das2. 3,并对重组菌培养及发酵产酶条件进行了优化。重组菌最适培养和产酶条件分别为甘油6 g/L、牛肉膏30 g/L、Na Cl 10 g/L; p H 7. 5、培养温度37℃、装液量100 m L (500 m L摇瓶)、培养30 h。在优化的条件下,发酵液中脱乙酰基酶酶活达到106. 42 U/L,较出发条件提高了424. 68倍,在5 L发酵罐培养30 h后,脱乙酰基酶酶活达到116. 13 U/L。研究实现了脱乙酰基酶的异源高效可溶性表达,为脱乙酰基酶的应用提供了基础。     

适应性进化和改造质粒稳定性促进枯草芽孢杆菌合成N-乙酰神经氨酸

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)作为营养化学品和药物中间体在保健品和医药领域具有广泛的应用。为了提升重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)合成NeuAc的产量,首先利用NeuAc生物传感器(NeuAc-Biosensor)调控抗生素抗性基因表达,在抗生素存在条件下将细胞生长与NeuAc合成相关联。进而通过增加抗生素浓度进行适应性进化,促进NeuAc合成效率提升。研究结果显示,当利用NeuAc-Biosensor分别调控壮观霉素抗性基因(spc)和红霉素抗性基因(erm)时,高产菌株能够在较高抗生素浓度条件下生长。通过在培养过程中逐步增加抗生素浓度开展适应性进化,结果表明采用壮观霉素和红霉素进行双抗性适应性进化时,进化获得的菌株中假阳性率(产量未提高的菌株比例)为46.7%,显著低于采用壮观霉素或红霉素单一抗生素进化获得的菌株中假阳性率(73.3%和66.7%)。通过适应性进化与发酵验证得到1株NeuAc产量为(3.16±0.19)g/L的菌株,产量比出发菌株提高了31.7%。为进一步解决发酵过程中重组B.subtilis质粒丢失的问题,通过将必需基因folB(编码二氢喋呤醛缩酶,dihydroneopterin aldolase)插入携带NeuAc合成途径关键酶编码基因重组质粒并且敲除基因组中的folB基因,质粒的丢失率由34.1%下降至11.8%。该研究提升了重组B.subtilis合成NeuAc的产量和稳定性,为重组B.subtilis发酵法生产NeuAc奠定了基础。     

金属离子协同氨基酸提高重组β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达

随着环糊精的应用越来越广,其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)已成为研究热点。为了克服天然菌种产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)能力低等缺陷,该文将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶基因插入质粒p ST中,构建了分泌型表达载体cgt/p ST并在宿主B.subtilis WB600中成功表达;通过对摇瓶发酵产CGT酶的条件进行优化发现,当发酵培养基为TB,p H为7.0时,37℃培养48 h后胞外酶活力达到27.9 U/m L,与天然菌株B.circulans STB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比,提高了近19倍;对TB培养基碳源、氮源进一步优化,以6 g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油,以30 g/L的酵母提取物作为氮源,胞外酶活可达到31.2 U/m L;亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达,而0.5mmol/L Fe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9 U/m L。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。     

纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析

纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的aprN基因编码,在体内外具有很强的溶解纤维蛋白活性。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增B.subtilis natto的aprN基因,并依据B.subtilis的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,构建了重组表达质粒pHT01-aprN。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其编码的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN导入B.subtilis,利用氯霉素抗性筛选获得B.s 168/pHT01-aprN工程菌。经IPTG诱导表达,摇瓶发酵培养最高酶活力为(289.00±3.42)U/mL,是野生菌的3.9倍,酶活力表达稳定性良好。     

枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5’-肌苷酸

5’-肌苷酸作为新一代增味剂的重要组成成分,在调味品行业具有十分重要的地位。为进一步缩短5’-肌苷酸生产周期,降低生产成本,在研究来源于摩氏摩根菌Morganella morganii的酸性磷酸酶AP/PTaseM催化条件基础上,将该酶编码基因pho CYM克隆至肌苷生产菌株Bacillus subtilis JG,获得B.subtilis JAB和B.subtilis JAF,并根据重组菌株合成肌苷及表达酸性磷酸酶的特性,通过调控发酵条件实现了肌苷发酵和酶催化相偶联的二步发酵法生产5’-肌苷酸。经摇瓶发酵实验验证,两菌株5’-肌苷酸产量分别为2.4 g/L和3.0 g/L。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

产碱性淀粉酶重组枯草芽孢杆菌的构建与发酵优化

碱性淀粉酶催化淀粉在碱性环境中高效降解,广泛应用于纺织退浆、洗涤、制药等领域。通过信号肽筛选,将来源于嗜碱单胞菌Alkalimonas amylolytica的碱性淀粉酶基因于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600实现分泌表达,并优化了重组菌产酶的发酵条件。在最佳信号肽ywb N介导下,重组B.subtilis发酵51 h,胞外Amy K酶活最高达146.86 U/m L,且能在发酵上清液中检测到与Amy K理论相对分子质量(60 k Da)一致的蛋白质条带。通过单因素实验优化了发酵培养基(糊精32 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母粉24 g/L,KH_2PO_42.32 g/L,K2HPO_4·3H_2O 16.43 g/L),并在发酵24 h后添加0.2 g/d L Na_2CO_3调节发酵液p H,发酵72 h胞外Amy K酶活达640.33 U/m L,较优化前提高了336%,是目前已报道重组B.subtilis产碱性淀粉酶的最高水平。研究结果为Amy K发酵生产的工业化提供了数据支撑。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

常压室温等离子诱变选育L-天冬酰胺酶高产重组菌

以Bacillus subtilis WB600为宿主,构建了能分泌表达L-ASNase的重组菌,并通过常压室温等离子体诱变进一步提高了重组菌的产酶量。重组Bacillus subtilis WB600(p MA5-wap Aans Z)发酵30 h,胞外酶活达到37.2 U/m L,表明L-ASNase在信号肽wap A介导下能分泌至胞外。在功率120 W、气流量10 L/min、诱变时间40 s的诱变操作条件下,对重组菌进行了等离子体诱变。突变株的酶活最高达48.4 U/m L,较诱变前提高30%。上述结果表明,常压室温等离子体诱变能有效提高重组菌产L-ASNase的酶活.研究结果为L-ASNase的工业化生产提供了高效的生产菌株。     

信号肽对Bacillus subtilis表达环糊精葡萄糖基转移酶的影响

将来源于作者所在实验室构建保存E.coli p ET-20b(+)/CGT△E-CBMAmy的CGT△ECBMAmy基因插入6种含有不同信号肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)的穿梭质粒p MA0911-SPs中,构建了6种重组表达载体并将其转入表达宿主B.subtilis WB600中,获得了6株重组菌。在相同的发酵条件下,est A信号肽介导的分泌效果最好,L-抗坏血酸2-葡萄苷产量达到0.81 g/L,明显高于其他5株重组菌。选取WBp MB/CGT△E-CBMAmy作为出发菌株,进行了摇瓶发酵条件优化,实现了CGT△E-CBMAmy酶的高效表达,最终使AA-2G产量提高了2.16倍,VC转化率达到21.9%。     

精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建

构建一种以L-苏氨酸为发酵底物的高值化学品2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)生产菌株,为解决L-苏氨酸产能过剩,实现2,5-DMP生物法生产提供可靠思路。通过利用Bacillus subtilis 168(B.subtilis 168)外源表达不同微生物种属来源的L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase,TDH),并比较其利用L-苏氨酸为底物合成2,5-DMP的产量,挑选出2,5-DMP高产菌种,在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX),以促进辅因子再生。实验构建了1株高产2,5-DMP的基因工程菌株B.subtilis 168/pMA0911-tdh(E.c)-nox。该菌株以5.83 g/L的L-苏氨酸为底物,发酵24 h后2,5-DMP的产量高达616.04 mg/L,与对照菌株B.subtilis 168/pMA0911相比,产量提高了22.5倍。在TDH过表达的基础上,NOX的参与有利于2,5-DMP产量的提高。该研究首次实现了2,5-DMP高效的生物转化,一方面缓解了L-苏氨酸产能过剩的困境,另一方面有助于实现高值风味化合物2,5-DMP的生物法生产。     

底物选择性大肠杆菌共发酵葡萄糖和木糖产生乙醇

为了实现混合糖发酵产乙醇过程中葡萄糖和木糖的同步利用,采用基因删除技术,经代谢工程改造,构建了葡萄糖/木糖选择性代谢产乙醇大肠杆菌,并通过摇瓶发酵试验研究双菌株共发酵产乙醇的发酵性能。在删除了甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸合成途径的出发菌株Escherichia coli B0013-1031 (pta-ackA,ldh A,pfl B,frd A)基础上,删除木糖异构酶基因xyl A,得到木糖不利用菌株B0013-2010;通过回复突变修复B0013-1031 xyl H功能,并删除其中葡萄糖运输和代谢途径关键酶基因pts G、glk和man Z,得到葡萄糖不利用菌株B0013-2011H。将携带Zymomonas mobilis乙醇合成途径关键酶基因pdc和adh B的质粒p Etac-PA分别转入上述菌株,获得产乙醇重组菌B0013-2010PA和B0013-2011HPA;以此双菌株共发酵葡萄糖和木糖合成乙醇,乙醇合成速率为1. 01 g/(L·h),葡萄糖和木糖消耗速率分别为2. 02 g/(L·h)和1. 05 g/(L·h)。双菌株共发酵显著改善了乙醇发酵过程葡萄糖和木糖的同步利用。