河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析

为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株,根据菌株形态和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性。结果表明,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔。序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和Fusarium nematophilum。致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生。      

云南省烟草镰刀菌根腐病病原鉴定

【背景和目的】烟草镰刀菌根腐病（Fusarium root rot）影响烟叶产量和品质,为明确云南省烟草镰刀菌根腐病病原种类。【方法】采用组织分离法分离病原并进行单孢纯化;结合形态学和分子生物学rDNA-ITS与EF-1α序列鉴定病原;采用灌根接种法测定病原菌的致病性。【结果】获得的300个菌株在PDA平板上均呈絮状,菌丝白色、紫色或粉红色,大型分生孢子无色、多孢、多为镰刀形;小型分生孢子无色、多无隔,呈椭圆形或纺锤形。经序列比对将300菌株鉴定为7个种,其中227株为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,占比75.7%;43株为茄病镰刀菌（F. solani）;16株为共享镰刀菌（F. commune）;8株为木贼镰刀菌（F. equiseti）;3株为层出镰刀菌（F. proliferatum）;2株芬芳镰刀菌（F. redolens）和1株轮枝镰刀菌（F. verticillioides）。【结论】云南省烟草镰刀菌根腐病病原为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、共享镰刀菌、木贼镰刀菌、层出镰刀菌、芬芳镰刀菌和轮枝镰刀菌,其中尖孢镰刀菌为优势菌。     

广东韶关烟区烟草镰刀菌根腐病病原鉴定及致病性分析

为明确广东韶关烟草镰刀菌根腐病菌种类及致病力，在珠玑、始兴、南雄和乌茎采集根腐病样本，用组织分离法分离病原菌，盆栽接种带菌麦粒测定其致病性，观察菌株形态，基于EF-1α和β-Tub基因序列构建发育树鉴定病原菌。结果表明，获得45株镰刀菌，通过形态特征和分子技术鉴定为茄病镰刀菌Fusarium solani、共享镰刀菌F. commune、藤仓镰刀菌F. fujikuroi和尖孢镰刀菌F. oxysporum，分别占比42.22%,26.67%、20.00%和11.11%，对烟草均有致病性，强弱排列为F.commune≈F. fujikuroi>F. oxysporum>F. solani。本研究可为广东韶关地区烟草镰刀菌根腐病的防治提供依据。     

烟草镰刀菌根腐病（Fusarium spp.）拮抗菌L210的鉴定及生防潜力评价

为筛选烟草镰刀菌根腐病（Fusarium spp.）的高效拮抗菌株,通过平板对峙、盆栽和大田复筛试验,从平顶山烟区烟株根际土壤中分离筛选拮抗菌;利用形态观察、生理生化测试和16S rDNA序列分析对拮抗菌进行鉴定,并对拮抗菌抗镰刀菌根腐病的机理进行研究。结果表明：从10份土壤样品中共分离土壤微生物菌株512株,其中以L210菌株对镰刀菌根腐病抑制效果最好,平板对峙抑菌直径71.4 mm,抑菌率为68.2%;盆栽和大田防病试验的发病率分别为0、6%,病情指数分别为0、1.5,防治效果分别为100%和77.9%。初步鉴定L210菌株为液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）,其抑菌机理为溶解尖孢镰刀菌的菌丝,使其失去侵染能力,进而抑制病原菌的生长。菌株发酵液中含有几丁质酶和纤维素酶,可溶解病原菌的细胞壁,还可显著诱导提高烟苗中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶的活性。因此,菌株L210在烟草镰刀菌根腐病的生物防治中具有较大的应用潜力。     

烟草镰刀菌根腐病的病原鉴定

为了探明烟草镰刀菌根腐病的病原菌分类地位,2015-2017年从福建省三明市主要烟区采集的烟草根腐病病样中分离获得31个镰孢菌属菌株（F1~F31）。对所分离的菌株进行形态学甄别、系统进化分析、种特异分子鉴定及致病性测定,结果表明分离菌株显微形态特征与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和共享镰刀菌（F. commune）相似;采用贝叶斯法（Bayesian Analysis）对4株分离菌F-04、F-18、F-19和F-28的rDNA基因内间隔区（IGS）基因作系统发育分析,结果显示这4个菌株同F. commune聚为一类并与F. oxysporum明确区分;特异性引物扩增鉴定结果表明分离菌株均为F. commune。通过室内与田间接种试验验证了分离菌株F. commune的致病性,明确其为烟草根腐病的主要病原物,这是我国首次报道共享镰刀菌F. commune引起烟草根腐病。      

烟草镰刀菌根腐病生防假单胞菌的筛选与鉴定

【背景和目的】镰刀菌引起的根腐病是烟草主要土传病害之一,为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好抑制作用的假单胞菌。【方法】采用稀释涂布平板法从健康烟株根际土壤中分离纯化对烟草镰刀菌根腐病（Fusariumrootrot）主要病原具有一定拮抗作用的假单胞菌;采用形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定,并测定促生防病效果。【结果】（1）分离纯化的2株假单胞菌分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa YZ66和绿针假单胞菌P. chlororaphis YX33;(2)YZ66和YX33对茄病镰刀菌（F.solani）菌丝的抑制效率分别为79.66%和76.68%,对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）的抑制效率分别为79.93%和57.48%,对烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）、根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）等也有抑制效果;（3）2株菌株具有显著的促生防病作用,YZ66盆栽防病效果在81.21%以上,YX33在67.55%以上;最大叶面积、鲜重等有所增加;（4）2菌株均含吩嗪-1-羧酸（Phenazine...     

甘肃窖藏马铃薯干腐病病原菌分离鉴定及致病性分析

目的 明确引起甘肃马铃薯主产区窖藏块茎干腐病致病菌的种类,确定强致病性的优势种群。 方法 通过组织分离获得病原菌,采用形态学结合真菌ITS序列进行菌种鉴定,用MEGA软件比较亲缘关系,根据柯赫氏法则测定分离菌株对‘大西洋’和‘陇薯7号’马铃薯微型薯的致病性。 结果 从采集的马铃薯罹病组织中分离纯化得到15株真菌,分别鉴定为三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、茄病镰刀菌（F. solani）、锐顶镰刀菌（F. acuminatum）、木贼镰刀菌（F. equiseti）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和环孢镰刀菌（F. annulatum）,分离频率在6.67%~26.67%之间。6种镰刀菌均可导致马铃薯块茎发病,其中锐顶镰刀菌、三线镰刀菌和茄病镰刀菌引起的病斑显著大于其他3种镰刀菌引起的病斑。结论 引起甘肃窖藏马铃薯干腐病的病原菌主要有三线镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和环孢镰刀菌,致病力强的优势种群为锐顶镰刀菌、三线镰刀菌和茄病镰刀菌。环孢镰刀菌作为马铃薯干腐病的致病菌属首次在我国被报道。     

根癌农杆菌介导的尖孢镰刀菌遗传转化体系构建

  背景和目的  尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）可引起烟草镰刀菌根腐病（Fusarium root rot of tobacco）,为明确病原菌致病相关基因。  方法  以烟草强致病性尖孢镰刀菌菌株B-9-1的分生孢子为受体,利用携带潮霉素B（hygromycin B,hyg）质粒的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化,获得能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的尖孢镰刀菌转化菌株,构建烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系。  结果  （1）尖孢镰刀菌的最优转化体系为:潮霉素B最适质量浓度50 μg/mL,在25℃条件下,以1 cm宽的条形硝酸纤维膜为载体,将携带有pCAM-GFP-hyg质粒的根癌农杆菌摇菌培养至OD₆₀₀=0.7,与震荡培养24 h获得的浓度为106个/mL的尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液在含有200 μmol/L乙酰丁香酮的共培养基上共培养48 h。（2）转化子继代培养、PCR检测和荧光显微观察结果表明外源GFP基因成功整合到烟草尖孢镰刀菌基因组中并可以进行稳定遗传表达。（3）Sourthern blot分析结果进一步证明T-DNA成功整合到尖孢镰刀菌基因组中,且60%以上为单拷贝插入。  结论  本研究成功构建了根癌农杆菌介导的烟草尖孢镰刀菌遗传转化体系,为烟草尖孢镰刀菌基因功能及病原菌的致病机制研究提供基础。      

棘孢木霉与30%霜霉·嘧菌酯协同防治烟草镰刀菌根腐病

为筛选防治烟草镰刀菌根腐病高效、安全的复配剂,采用菌丝生长速率法测定生防棘孢木霉Tr-0111、化学杀菌剂30%霜霉·嘧菌酯对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的毒力及两者的相容性,同时测定两者混配对尖孢镰刀菌的毒力系数,并通过盆栽试验评价其对烟草镰刀菌根腐病的防治效果。结果表明,30%霜霉·嘧菌酯和棘孢木霉Tr-0111对尖孢镰刀菌均具有较强的毒力,其EC₅₀值分别为0.064 3 mL/L、2.36×10² cfu/mL,且两者相容性好。除V_{30%霜霉·嘧菌酯}∶V_Tr-0111=4∶6时无增效作用,其他8个混配比例均具有增效作用,其中V_{30%霜霉·嘧菌酯}∶V_Tr-0111=7∶3时增效比率最高,为1.16,抑菌率为68.37%。盆栽试验结果表明,V_{30%霜霉·嘧菌酯}∶V_Tr-0111=5∶5时,对烟草镰刀菌根腐病的防效最好,为78.18%,其次为7∶3和1∶9,防效分别为77.27%和72.7...     

3株拮抗烟草尖孢镰刀菌的木霉菌筛选鉴定及促生防病效果评价

  目的  为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好拮抗效果的菌株。  方法  从河南省主要烟叶产区健康烟株根际土壤中,分离纯化对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有一定拮抗作用的真菌菌株,对筛选出的拮抗菌株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定促生作用和防治效果。  结果  分离纯化得到的3株木霉菌分别为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）Ta-0101、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）Th-0201和毛簇木霉（Trichoderma velutinum）Tv-0207,具有较强的抑菌能力,对尖孢镰刀菌的抑菌率分别为91.24%、84.71%和82.48%。3株木霉菌对烟草种子根长和总长均有显著的促生效果,根长增长率分别为28.89%、25.92%和22.22%,根系活力也显著提高;对烟株最大叶面积和鲜重的促生作用明显,其中棘孢木霉Ta-0101促生效果最显著。3株木霉菌对尖孢镰刀菌的相对盆栽防效分别为78.95%、69.73%和69.73%,均高于70%甲基硫菌灵1000倍液处理的防效。  结论  3株拮抗木霉菌具有较好的抑菌效能和促生防病效果,应用前景良好。      

烟草品种对镰刀菌根腐病的抗性鉴定

采用盆栽烟株带菌麦粒接种法测定12个烟草品种（系）对烟草镰刀菌根腐病的苗期抗病性,结果表明,中烟98、贵烟6号、云烟87、7478、NC89和豫烟13号对镰刀菌具有较高抗性,KRK26、中烟100和中烟205中等抗病,小黄金1025、豫烟10号和长脖黄对镰刀菌易感,在所有测试样品中,长脖黄抗性最低。长脖黄、小黄金1025和豫烟10号可作为对镰刀菌根腐病检测预警材料及镰刀菌根腐病的感病对照样品应用于相关研究中。      

基于FUNGuild的镰刀菌根腐病发病烟株根际真菌群落研究

为了解镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株在根际真菌群落结构与功能上的差异,联合应用高通量测序和FUNGuild技术研究了镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株根际土壤中的真菌群落,结果表明:（1）镰刀菌根腐病发病烟株根际真菌群落的Shannon指数为4.14,而未发病烟株则高达4.71,未发病烟株根际真菌群落多样性显著高于发病烟株,镰刀菌根腐病发病烟株与未发病烟株根际土壤中的真菌群落在组成上有显著差异;（2）镰刀菌根腐病发病烟株根际真菌以病理营养型为主,占54.64%,而未发病烟株根际真菌则以腐生营养型为主,占46.10%;（3）镰刀菌根腐病发病烟株根际的病原菌相对丰度为30.73%,显著高于未发病烟株的1.12%,镰刀菌在病原菌群落中占绝对优势地位。高通量测序与FUNGuild联用可对土传病害感病烟株的根际优势病原真菌群落进行准确鉴定,可为烟草病害的防控提供科学参考。      

云南省烟草镰刀菌根腐病菌遗传多样性分析

  背景和目的  尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的根腐病是烟草主要的土传病害,在云南烟区普遍发生。为分析云南省不同地理来源尖孢镰刀菌的遗传差异性和亲缘关系。  方法  采用ISSR（inter-simple sequence repeat）和SRAP（sequence- related amplified polymorphism）分子标记技术分析40株菌株遗传多样性。  结果  （1）采用ISSR技术,供试的7条引物共扩增出53条条带,其中多态性条带44条,平均多态性条带83.02%。菌株间的遗传相似系数为0.49~0.96,存在遗传背景差异。遗传相似系数为0.68时,40株菌株可分为3个类群。（2）采用SRAP技术,供试的7对引物共扩增出44条条带,其中多态性条带32条,平均多态性条带72.73%,菌株间的遗传相似系数为0.55~0.96。遗传相似系数为0.70时,40株菌株可分为3个类群,结果与ISSR一致。  结论  云南省烟草尖孢镰刀菌菌株间遗传差异大,ISSR和SRAP分子标记技术可用于烟草尖孢镰刀菌的遗传多样性分析。      

洛阳烟区烟草白粉病病原鉴定及寄主调查

为明确洛阳烟区烟草白粉病的病原菌及其寄主植物种类,通过形态学观察和分子生物学方法鉴定了从洛阳烟区采集的烟草白粉病样品的病原菌,并采用致病性测定与分子生物学分析相结合的方法,检测其在洛阳烟区的寄主范围。结果表明：(1)洛阳烟区烟草白粉病病原菌为烟草高氏白粉菌（Golovinomyces tabaci）;(2)除烟草外,采集的烟田周边22种感染白粉病植物的病原菌均不为烟草高氏白粉菌（G. tabaci）且这些病原菌对烟草均不具有致病性;(3)采集的烟草白粉病样品的病原菌对烟田周边22种健康植物中车前草和豌豆具有致病性,分子生物学鉴定结果进一步证实了车前草和豌豆为洛阳烟区烟草白粉病病原菌的寄主植物。     

吉林省和黑龙江省烟草赤星病病原鉴定

为明确吉林省和黑龙江省烟草赤星病病原菌的种类,对吉林省15个烟区和黑龙江省7个烟区的烟草赤星病病原菌进行了分离鉴定,共分离获得312株致病菌株。通过形态学和分子生物学鉴定,共鉴定出4种链格孢属真菌,其中链格孢（Alternaria alternata）230株,细极链格孢（Alternaria tenuissima）78株,鸭梨链格孢（Alternaria yaliinficiens）2株,长柄链格孢（Alternaria longipes）2株。其中吉林省烟区鉴定出了链格孢、细极链格孢和鸭梨链格孢3种,黑龙江省烟区鉴定出了长柄链格孢、链格孢和细极链格孢3种。两个省区的优势种均为链格孢。此外,本试验利用5种基因序列片段（ITS、GDP、ACT、EF、RPB2）进行烟草赤星病菌的分子生物学鉴定,其中GDP基因仅能鉴定出链格孢和细极链格孢2种,RPB2基因能鉴定出4种链格孢,而ITS、EF、ACT基因序列比较保守,不适合区分这些链格孢种。本研究明确了吉林省和黑龙江省烟区引起烟草赤星病的病原菌种类,为下一步的定向防控奠定了基础。     

烟草弯孢菌叶斑病病原菌鉴定及生物学特性研究

为明确贵州烟草弯孢菌叶斑病病原菌种类及生物学特性,分别采用组织分离法和离体叶片接种法对其病原菌进行分离和致病性测定,使用形态特征结合分子生物学方法对病原菌进行分类鉴定,并对其生物学特性进行研究。结果表明,该病原菌在以ITS序列构建的发育树中与棒状弯孢（Curvularia clavata）聚为一支,且支持率为100%,结合形态特征将其鉴定为棒状弯孢。生物学特性研究表明,病原菌菌丝生长最适温度为28℃,最适pH为8,在燕麦琼脂（OA）培养基上生长最快,以可溶性淀粉为碳源、牛肉浸粉为氮源时对菌丝生长最有利;菌丝致死温度为53℃,10 min,光照对菌丝生长无显著影响。研究结果可为烟草弯孢菌叶斑病防治提供理论依据。     

接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病抗性的影响

为探讨丛枝菌根真菌(Glomus intraradices和Glomus mosseae)对烟草青枯病抗病性的影响,采用盆栽试验研究了接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病发病情况、抗病相关酶活性及丙二醛含量的影响。结果显示,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae可促进烟草植株生长,烟株地上部和根系的干质量和磷含量以及地上部的氮含量显著增加,同时烟草青枯病的病情指数及发病率降低;在接种青枯菌条件下,与对照(烟株接种病原菌,但不接种丛枝菌根真菌)相比,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae后,烟草叶片过氧化物酶活性分别增加22.9%和26.9%,同时丙二醛含量呈下降趋势。表明接种丛枝菌根真菌能提高烟株对烟草青枯病的抗性。     

河南烟草镰刀菌的初步分子鉴定

为了明确河南烟田危害烟草的镰刀菌种类,以烟叶主产区典型病株为样本,用组织分离法获得纯菌株,并对所得菌株进行形态学鉴定、rDNA-ITS序列分析及致病性测定.形态学观察结果表明,分离获得的22个菌株在PDA培养基上均产生茂密的菌丝,呈棉絮状,能产生黄、红、紫等色素,大型分生孢子镰刀形或椭圆形,无色、多胞;小型分生孢子卵形至椭圆形,无色、单胞或双胞.BLAST比对结果表明,在GenBank序列数据库中,菌株1～11号的DNA序列与登陆号为KC429789.1的Fusarium oxysporum (F.oxysporum)序列同源性达到95.77％以上;菌株12～18号与登陆号为JQ910159.1的Fusarium solani (F.solani)序列的同源性达到88.01％以上;菌株19～21号与登陆号HQ176444.1的Fusarium verticillioides (F.verticillioides)序列的同源性达到89.72％以上;菌株22号与登陆号为JX045841.1的Fusarium proliferatum(F.proliferatum)序列的同源性为90.74％.接种试验表明,4种镰刀菌均能侵染活体烟苗并产生典型症状.因此,河南烟田危害烟草的镰刀菌鉴定为F.oxysporum,F.solani,F.verticillioides及F.proliferatum.其中,F.proliferatum侵染烟草在河南为首次报道.     

基于傅里叶变换红外光谱技术对木耳中镰刀菌的识别检测

该研究建立了一种基于傅里叶变换红外光谱的木耳中镰刀菌的定性定量检测方法：对经高压灭菌的木耳样品分别接种木耳中常见的五种镰刀菌（层出镰刀菌189975、串珠镰刀菌340687、尖孢镰刀菌120618、木贼镰刀菌124121、茄病镰刀菌121547）,并于28 ℃,相对湿度80%的条件下进行储存培养,同时采集不同储存阶段的木耳样品在1 800~900 cm-1的红外光谱信息。分别运用主成分分析（PCA）、线性判别分析（LDA）以及偏最小二乘回归分析（PLSR）建立木耳中镰刀菌的快速识别检测模型。结果表明：LDA模型对受不同镰刀菌侵染的木耳样品的平均判别正确率达到87.50%,对受单一镰刀菌侵染的木耳样品霉变状态的平均判别正确率达到82.50%;PLSR模型对木耳样品中菌落总数的预测实现了较好的定量结果（R2 p=0.842 8,RMSEP=0.292 log CFU/g,RPD=2.81）;通过实际样品验证分析表明傅里叶变换红外光谱方法可以实现木耳中镰刀菌的快速识别检测。     

烟草镰刀菌根腐病抗性鉴定方法研究

为获得不同烟草品种镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法，采用镰刀菌粗毒素幼芽接种、孢子悬浮液培养、带菌菌谷接种、离体叶片菌饼接种、草酸局部注射等5种方法对4个品种（小黄金1025、中烟100、长脖黄、664-01）的镰刀菌抗病性进行了研究。结果表明，镰刀菌毒素液胁迫法可以鉴定品种的抗感程度，适宜体系毒素浓度为8%，处理时间6d；镰刀菌孢子悬浮液接种法可以鉴定品种的抗感程度，适宜体系孢子液浓度为107个/mL，处理时间4 d；带菌菌谷接种也可以鉴定品种的抗感程度，适宜体系菌谷比例为20%，处理时间9 d；离体叶片用菌饼和草酸液处理，能区分品种的抗感性，但不能区分品种的抗感程度。研究结果认为孢子悬浮液接种法和带菌菌谷接种与其他3种方法相比可以准确评价品种对镰刀菌根腐病的抗感性。