全细胞催化合成L-苯基乳酸重组大肠杆菌的构建

苯基乳酸是一种新型天然广谱抑菌物质,L-乳酸脱氢酶是微生物转化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的关键酶,通过构建过量表达L-乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌,提高大肠杆菌合成L-苯基乳酸(苯基乳酸,phenyllactic acid,PLA)的能力。以Bacillus megaterium Z2013513基因组为模板,经PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因,连接表达载体p ET-28a(+)并导入到大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET-28a-ldh L。SDS-PAGE电泳和酶活分析表明,约在40 ku处出现显著特异性条带,粗酶液酶活力达3.4 U/mg。在37℃、200 r/min条件下,25 g/L(干重)重组大肠杆菌经60 min将70.32 mmol/L苯丙酮酸全细胞转化合成50.59 mmol/L L-苯基乳酸。由于具有较高的产物光学纯度(96.98%e.e.)和底物摩尔转化率(71.94%),表明一步生物转化法能高效地合成L-苯基乳酸。     

牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

利用PCR方法从牛链球菌(Streptococcus bovis)基因组DNA中扩增出了L(+)乳酸脱氢酶基因(ldh),并将其连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSEldh,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株JM109。利用SDS-PAGE分析ldh表达产物的分子量为36KD,重组菌株的乳酸脱氢酶酶活力为168.2U/mL,最适反应温度25℃,最适作用pH为5.0,重组质粒的稳定性达99.9%。     

重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldh L)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldh L分别连接至表达载体p ETDuet,获得共表达质粒p ETDuet-ldh L-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/p ETDuet-ldh L-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。     

不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-Lc LDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-Lc LDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E. coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值 99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-Lc LDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32 585和5.5;L-Lc LDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-Lc LDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。     

乳酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化合成D-苯基乳酸

D-苯基乳酸(D-phenyllactic acid,D-PLH)是一种理想的天然防腐剂,具有广谱抗菌活性。实验构建了1株乳酸脱氢酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-ldh,并对其诱导表达条件进行了优化。在最优条件下(当OD_(600)值达到0.8时,添加乳糖8 g/L,在28℃下诱导8 h),重组乳酸脱氢酶比酶活达到298.8 U/g(干菌体)。建立了乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶双酶偶联催化体系,并应用于苯丙酮酸钠还原生成D-苯基乳酸。对反应条件,包括温度、pH值、两重组菌质量比和葡萄糖浓度进行了优化,在最优反应条件下,D-苯基乳酸累积质量浓度达到18.03 g/L,时空产率为162.27 g/(L·d),ee99%。双酶耦联催化体系是D-苯基乳酸合成的有效工具,显示了良好的应用前景。     

米根霉乳酸脱氢酶的特性研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸过程的关键酶。本研究从米根霉As3.819中初步分离出乳酸脱氢酶,并结合发酵条件对其酶学特性进行了研究。结果表明,该乳酸脱氢酶的最适反应pH为7.4,最适催化温度为30～50℃。Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,K+、Zn2+对该酶有抑制作用。以NADH和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7.22×10-4mol/L和1.24×10-3mol/L。     

凝结芽孢杆菌中与乳酸生产相关的乳酸脱氢酶基因的研究

对5株凝结芽孢杆菌乳酸生产情况进行研究,并以凝结芽孢杆菌ATCC7050作为乳酸脱氢酶基因研究的对象,确定得出其乳酸生产关键的乳酸脱氢酶基因。结果表明:凝结芽孢杆菌生产的乳酸分两种类型:L型乳酸和D型乳酸,但主要以L型乳酸为主,其光学纯度达到97%以上。在凝结芽孢杆菌ATCC7050基因组中存在的ldhL1、ldhL2和ldhD三种乳酸脱氢酶基因中,ldhL2基因没有检测到转录信号,而ldhD转录水平很低,在生长对数期ldhL1基因的转录水平是ldhD基因转录水平的68倍,这说明ldhL1基因是凝结芽孢杆菌ATCC7050乳酸生产的关键性基因。本研究确定了凝结芽孢杆菌ATCC7050乳酸合成中最主要的乳酸脱氢酶基因,对凝结芽孢杆菌代谢研究和基因改造奠定了基础。     

副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的生物信息学分析

目的：分析和预测副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因及其编码蛋白的结构和特性,以指导其生物学功能的实验研究。方法：利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件,如ClustalX、VMD,从数据库中得到乳酸脱氢酶基因,分析、预测该基因编码的蛋白理化性质、翻译后的修饰位点、拓扑结构、二级结构、三级结构和功能域。并与其他微生物的乳酸脱氢酶蛋白序列进行比对,得出它们的保守序列。结果：该基因编码335个氨基酸,其蛋白理论分子质量为36608.8u,预测该蛋白有3个跨膜区。与干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶进化关系最近。结论：应用生物信息方法可预测得到副干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶的结构与功能方面的信息。     

产高纯度L-乳酸大肠杆菌基因工程菌的初步研究

本文以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)基因组为模板,扩增出L-乳酸脱氢酶基因ldh,将其连接到表达载体pSE380,转化到D-乳酸脱氢酶及丙酮酸甲酸裂解酶双缺失的大肠杆菌FMJ144中,摇瓶发酵得到3.5g/L的高纯度为99%的L-乳酸。     

植物乳杆菌LY-78乳酸脱氢酶基因的生物信息学分析

目的:探究植物乳杆菌LY-78菌株全部5个乳酸脱氢酶基因及其编码蛋白质的结构和功能。方法:应用多种生物信息学软件对植物乳杆菌LY-78菌株的5个乳酸脱氢酶基因及氨基酸序列进行结构分析和功能预测。结果:植物乳杆菌LY-78中5个乳酸脱氢酶的核苷酸及氨基酸序列均具有较高的保守性,均为位于细胞质的热稳定性、非分泌、非跨膜蛋白,除了ldh L3基因,其余4个基因均具有各自高度保守的功能位点和结构域,均存在典型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)结合位点序列GXGXXG。结论:乳酸脱氢酶D1(D1-lactate dehydrogenase,D1-LDH)、D2-LDH、L1-LDH及L2-LDH均具有完整的功能位点和结构域,很可能具有真正的乳酸脱氢酶活性,L3-LDH由于缺失NAD~+结合结构域和功能位点,因而可能不具有乳酸脱氢酶活性,这些分析结果为今后植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因改造和苯乳酸合成代谢机制研究提供了必要的理论基础。     

植物乳杆菌生物合成苯乳酸条件优化研究

以苯丙酮酸为底物,以植物乳杆菌静息细胞为催化剂,对苯乳酸生物合成条件进行了优化。 试验首先确定了不同因素对苯 乳酸产量的影响,然后通过正交试验优化了最佳合成条件。 结果表明,细胞培养时间为18 h时催化活性最高,且在温度为35 ℃,pH 为6.5,静息细胞、苯丙酮酸和葡萄糖质量浓度分别为80 g/L、3.0 g/L和4.0 g/L的催化条件下,经过4 h转化,苯乳酸产量达到最高,为 1.68 g/L。 在最优条件下,静息细胞重复利用4次,苯乳酸产量没有显著降低,表现出了植物乳杆菌转化苯丙酮酸合成苯乳酸的良好稳 定性。     

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对过敏原原肌球蛋白免疫活性的消减作用

为探究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对过敏原原肌球蛋白（tropomyosin,TM）免疫活性的影响,以富集纯化的TM为研究对象,利用植物乳杆菌的菌体、破碎内容物、菌体碎片、胞内酶提取液,以及去除蛋白、脂肪和脂磷壁酸、羧基酯化、氨基甲基化后的菌体分别水解TM 12～48 h,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白免疫印迹和竞争性酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等方法测定免疫活性,利用表位多克隆抗体结合红外光谱技术研究植物乳杆菌对TM二级结构及其致敏表位的影响,以解析植物乳杆菌消减TM免疫活性的作用位点。免疫学分析结果发现,不同提取物水解TM 48 h后,菌体对TM免疫活性的消减率最高（76.9%）,而菌体碎片和氨基甲基化菌体的消减率最低,分别为60.7%、61.7%,表明植物乳杆菌对原肌球蛋白免疫活性有一定消减作用。红外光谱及ELISA结果显示植物乳杆菌各成分提取物会较大程度改变TM的二级结构并破坏其致敏表位,而氨基甲基化菌体和菌体碎片对TM的α-螺旋结构和致敏表位的破坏最小,且TM的折叠化结构较少,对TM免疫活性消减效果最差。此外,研究发现氨基可能是植物乳杆菌消减TM免疫活性的一个重要作用位点。本研究可为食物过敏原的活性控制及低致敏性水产加工制品的开发提供理论参考。     

自然发酵三樱椒中乳酸菌的分离及鉴定

为获得适用于三樱椒发酵的乳酸菌,该研究采用钙溶圈法从自然发酵三樱椒中分离乳酸菌,通过形态观察和分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其生长、产酸、耐酸特性进行分析。结果表明,从自然发酵三樱椒中共分离纯化得到19株乳酸菌,经鉴定,16株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,3株为赫轮魏斯氏菌（Weissella hellenica）。培养初期,赫轮魏斯氏菌生长比植物乳杆菌快,但培养12 h后植物乳杆菌比赫轮魏斯氏菌生长速度更快;植物乳杆菌产酸能力优于赫轮魏斯氏菌,培养21 h后,植物乳杆菌发酵液的pH值稳定在3.7,赫轮魏斯氏菌发酵液pH值稳定在4.3,其中植物乳杆菌PLP-1产酸能力最好;植物乳杆菌的耐酸性优于赫轮魏斯氏菌,在pH值＜4.0的培养条件下赫伦魏斯氏菌生长受到严重抑制,而植物乳杆菌可以在pH值为3.0的培养基中生长,其中植物乳杆菌PLP-1耐酸性最好。     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

乳酸菌发酵大豆糖蜜生产乳酸及糖代谢变化

选用德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.8501、嗜酸乳杆菌KLDS1.0327、嗜酸乳杆菌ATCC11975、植物乳杆菌植物亚种CICC23168、干酪乳杆菌ATCC393、植物乳杆菌NAU322分别接种于大豆糖蜜,用高效液相色谱法测定乳酸的产生以及碳水化合物的利用情况,分析不同乳酸菌发酵大豆糖蜜生产乳酸能力及糖代谢能力。结果表明,在15 °Brix大豆糖蜜中,37?℃、pH?6.0条件下发酵24?h,植物乳杆菌植物亚种CICC23168的活细胞数达到6.66×109?CFU/mL,乳酸产生量为12.18?g/L,总糖消耗量为22.48?g/L,与其他菌株相比有明显优势。因此,植物乳杆菌植物亚种CICC23168是能利用大豆糖蜜发酵产乳酸的潜力菌株。     

高纯度诊断用乳酸脱氢酶的制备和酶促反应

设计并优化了植物乳杆茵发酵制备高纯度诊断用乳酸脱氢酶的技术路线．从培育的厌氧型植物乳杆茵中粗提乳酸脱氢酶制备液，经过DEAE Sepharose F．F．离子交换层析、Phenyl Sepharose6 F．F．疏水层析及Sephadex G-25 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化，比酶活达1096．8U／mg，纯度达88％，纯化倍数达到21．4倍，酶活力回收率为53．9％；高效液相色谱和SDS-PAGE电泳结果显示制得乳酸脱氢酶相对分子质量约为80000，含有两个亚基，每个亚基分子量约为39000．     

Expression of the catalase gene katA in starter culture Lactobacillus plantarum TISTR850 tolerates oxidative stress and reduces lipid oxidation in fermented meat product

The catalase gene katA of Lactobacillus sakei SR911 was cloned and expressed in Escherichia coli UM2 and Lactobacillus plantarum TISTR850 under strong lactococcal promoter P59 in E. coli-lactococcus expression vector pIL1020. The L. plantarum TISTR850 is a catalase-deficient strain isolated from local fermented meat product. The recombinant L. plantarum TISTR850 was shown to decompose hydrogen peroxide, and catalase activity approximately three times higher that of natural catalase-producing strain L. sakei SR911. The recombinant protein was also detected by in situ activity staining of the catalase enzyme. The recombinant L. plantarum TISTR850 did not accumulate hydrogen peroxide under glucose-limited aerobic conditions and remained viable after 60 h of incubation. The recombinant and host strain L. plantarum TISTR850 were used as starter cultures in the fermented meat product, and lipid oxidation was monitored over a 7-day storage at 20 degrees C determined as thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) value. The lipid oxidation level in the fermented meat product seeded with the catalase genetically modified starter culture L. plantarum TISTR850 was significantly lower than that of the natural catalase-deficient strain.     

植物乳杆菌ZS2058中亚油酸异构酶的定位研究

植物乳杆菌ZS2058是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有亚油酸异构酶活性的乳酸茵.本文对植物乳杆茵ZS2058中亚油酸异构酶的部分粗酶性质进行了考察,建立了初酶活性检测方法,在此基础上对此亚油酸异构酶在细胞中的定位进行了研究,这将为后续分离纯化此亚油酸异构酶提供理论依据与指导.考察的结果是超声波破碎获得亚油酸异构酶初酶液的最佳条件为破碎功率400W,破碎时间7.5min(破碎5s,间歇9s).初酶活性测定时的最适亚油酸底物浓度为0.08 mg/mL;EGTA等金属螯合剂及Ca2+对亚油酸异构酶活性的影响均不显著;粗酶液经超高速离心分级沉淀和加入去垢剂Triton X-100提取的实验结果表明,该亚油酸异构酶为细胞膜结合酶.     

All 4 bile salt hydrolase proteins are responsible for the hydrolysis activity in Lactobacillus plantarum ST-III

In vertebrates, bile salt hydrolysis plays an essential role in fat metabolism. Bile salts are synthesized in the liver. And in the small intestine glycine and taurine are de-conjugated from bile salts by the enzyme bile salt hydrolase (BSH) from intestinal microbes. However, the mechanism of bile salt hydrolysis in Lactobacillus plantarum is still ambiguous. Four predicted bile salt hydrolase (bsh) genes from L. plantarum ST-III were cloned into Escherichia coli. The function of these genes was explored by overexpression. All 4 proteins that were studied showed activity against glycine- or taurine-conjugated bile salts. Substrate preference was also observed in BSH proteins, especially for the enzyme BSH1, which had high hydrolysis activity for glycodeoxycholic acid. These results suggest that all 4 bile salt hydrolases may be responsible for the bile salt hydrolysis activity in L. plantarum ST-III. PRACTICAL APPLICATION: Hypercholesterolemia is considered one of the major risk factors for coronary heart disease. More interest has focused on intestinal microbes because of their role in the decrease of serum cholesterol. BSH proteins play an important role in the reduction of cholesterol. This paper adds to a better understanding of BSH proteins of intestinal microbes. It gives a great hint that probiotics can be used to solve hypercholesterolemia one day.     

植物乳杆菌UA149的降尿酸作用

为了筛选具有降尿酸作用的乳酸菌新菌株,本研究以自主分离鉴定的5株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)为研究对象,对其体外降解嘌呤核苷能力进行了评价,获得植物乳杆菌UA149是一株降解嘌呤核苷能力较强的菌株,并通过动物体内实验评价了该菌株降尿酸作用和机制。以氧嗪酸钾联合果糖诱导高尿酸血症大鼠模型,植物乳杆菌UA149菌液连续灌胃两周,测定血清中尿酸、黄嘌呤氧化酶和炎症因子水平等相关生化指标,并采用蛋白杂交技术,探讨植物乳杆菌UA149降尿酸的作用机制。结果表明:植物乳杆菌UA149能够显著降低高尿酸血症模型大鼠血尿酸水平(39.71%),降低血清黄嘌呤氧化酶活性(15.36%),降低白三烯(25.81%)、血栓素(38.40%)和炎症因子水平(IL-1 26.89%、IL-8 10.40%、IL-6 17.29%、IL-1β20.95%和TNF-α23.09%)。植物乳杆菌UA149可以通过调节AMPK/NF-κB/NLRP3信号通路来减缓高尿酸血症引起的肾脏炎症反应。说明植物乳杆菌UA149可作为益生菌用于高尿酸血症的预防和辅助治疗。