细菌的活的非可培养状态及其研究进展

细菌的活的非可培养状态是指细菌具有生物活性和毒性,但用常规培养法检测不出来的一种特殊生理状态。由于这种状态在特定条件下可以复苏,将培养出来和致病,所以研究细菌的活的非可培养状态对正确地评价食品的卫生状况,改进检验方法具有重要的意义。本文介绍了细菌进入活的非可培养状态的各种诱导因素;活的非可培养状态细菌的生理特征;已研究的能进入活的非可培养状态的细菌种类;细菌的活的非可培养状态的检测方法;最后阐述了进行细菌的活的非可培养状态研究的重要意义。     

细菌活的非可培养状态研究

综述了细菌活的非可培养状态的导致原因、生物学特性、检测及复苏方法,通过对活的非可培养状态的研究,使相关研究人员更加深刻的了解和认识活的非可培养状态下的细菌特性,从而对非可培养状态病原菌的防控起到积极的作用。通过细菌VBNC状态的综述进而对益生乳酸菌VBNC状态的研究提出新的思路,以解决乳酸菌发酵剂工业化生产中所面临的问题。     

弧菌VBNC状态的研究进展

细菌的活的非可培养(VBNC,VNC)状态是在不良环境下细菌具有生物活性和毒性,用常规培养法无法检出,却在一定条件下可以复苏并保存致病性的一种特殊生理状态。本文综述了三种常见致病性弧菌的活的非可培养状态下的生物学特性、形成机制及其复苏的研究。运用现代生物技术手段,深入地研究细菌的VBNC状态,对食品卫生与安全具有重要的意义。     

两种卫生指标菌在瓶装水中 “活的非可培养状态”的研究

在瓶装水的微生物指标检测中,大肠菌群通常作为微生物污染的指标菌。研究发现,经低温或Cu2+ 诱导可使大肠杆菌进入“活的非可培养状态”,这种状态下的大肠杆菌,在国家标准检测方法提供的培养基上不会出现菌落,检测结果为阴性。同时对另一种革兰氏阳性致病菌金黄色葡萄球菌进行研究,发现其同样存在非可培养状态,证明了现阶段的检测方法,将会造成该状态下微生物的直接漏检。在“活的非可培养状态”的复苏实验中,发现过氧化氢酶和吐温20 可以使处于非可培养状态中的两种细菌在短时间内实现复苏,重新具有可培养性。     

“活的非可培养态”食源致病细菌的研究进展

食源致病细菌是影响食品质量与安全的重要生物污染源。食品加工过程中的低温、寡营养及食品防腐等条件可诱使食源致病细菌进入活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC),处于此状态的细菌最大的特点就是丧失了平板上的生长繁殖能力,但生命体征是活的,并且保留原菌的毒力和致病性。研究表明,活的非可培养态细菌在细胞形态、基因表达、蛋白表达等方面发生了复杂变化,并且一定条件下可复苏为可培养状态,成为逃避检测的"隐性传染源",对食品安全构成潜在威胁。文中对食源性致病菌VBNC态的诱导条件及复苏情况、生物学特性变化、现代检测技术的发展等方面的研究进行了综述。期望为解决当下由活的非可培养态细菌引起的食品安全问题提供理论参考。     

细菌活的非可培养状态的研究现状及发展趋势

微生物是危害食品质量安全的重要因素。细菌活的非可培养状态的概念提出,对于微生物学、食品质量安全、水质管理、流行病学等方面,都有重大意义。对细菌活的非可培养的研究现状及发展趋势进行了综述。     

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入"活的非可培养"(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。     

叠氮溴化丙锭(PMA)在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素,对食源性致病菌进行检测是控制食源性疾病的关键环节。传统检测技术无法检测活的非可培养状态(VBNC)的细菌。基于核酸的检测方法克服了这一缺陷,然而难以区分"死菌"与"活菌"。叠氮溴化丙锭(PMA)为一种对死菌核酸具有高度结合能力的光敏染料,近年来,将其与核酸检测技术相结合,广泛应于多种食源性致病菌的活菌检测。本文综述了PMA的作用机理,影响PMA活菌检测的因素以及PMA在常见食源性致病菌检测中的应用,并预期PMA的进一步应用与后续研究情况。     

乳及乳制品中常见“活的非可培养态”食源致病菌研究进展

细菌在环境胁迫下能够进入一种“活的非可培养态”（viable but nonculturable state,VBNC）,常规的平板培养方法无法检测出该种状态细菌,但其仍具有可测量的代谢活性,能够在适合的条件下复苏并产生毒力。乳及乳制品因其含有丰富的营养物质而成为理想的细菌培养基,其中几种常见的食源致病菌如副溶血性弧菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌等也被证实能够进入VBNC,对乳及乳制品品质安全造成严重威胁。因此,本文综述了VBNC细菌的研究进程和细胞形态、毒力等生理学特性,并介绍了乳及乳制品中几种常见VBNC致病菌的诱导与复苏因素及其检测方法。通过对VBNC细菌的综述进而为乳及乳制品中致病菌研究提供新思路,以期减少乳及乳制品中该状态致病菌对公共安全的威胁,提升乳及乳制品中生物性安全水平。     

细菌活的非可培养状态的分子生物学检测技术研究进展

许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检,应用分子生物学检测技术可以提高VBNC细胞的阳性检出率。针对VBNC细胞的分子生物学检测技术,基于细菌特异性DNA分子、mRNA分子是目前常用的检测方法,而利用报告基因(如绿色荧光蛋白基因)检测VBNC细胞是一种有效的方法。最近利用叠氮溴乙锭 (ethidium monoazide bromide,EMA)或者叠氮溴化丙锭 (propidium monoazide,PMA)联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增,该方法结合了EMA(PMA)选择渗透性和PCR特异性,作为一种区分细胞死活的方法,可以有效检测细菌VBNC细胞。     

一种检测活的非可培养状态空肠弯曲菌的新方法

为提高活的非可培养状态空肠弯曲菌的检出率,建立了一种免疫磁珠捕获-荧光聚合酶链式反应法。该法包括应用免疫磁珠技术制备弯曲菌免疫磁珠,以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌,并设计了检测空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与荧光标记探针。结果表明:磁捕获-荧光聚合酶链式反应法可直接检测空肠弯曲菌,无需增菌培养,具有灵敏度高、选择性好、简便、快速等特点,可在24h内完成样品中活的非可培养状态空肠弯曲菌的检测。     

食源性微生物VBNC状态检测与分离方法的研究进展

在环境胁迫下,部分食源性微生物(大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、乳酸菌和酵母等)会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable,VBNC)得以存活。进入VBNC状态的微生物在细胞形态、代谢活性以及致病性等方面发生了变化,并且不能用常规的方法将其检出,因此给食品质量与安全带来了极大的挑战。本文总结了食源性微生物VBNC状态的发展趋势;简单介绍了食源性微生物VBNC状态的各种环境诱导因素、生理生化特性和复苏条件;着重论述了应用于食源性微生物VBNC状态的分子检测技术和噬菌体检测法,并讨论了方法的优缺点及优化方案。此外,本文还总结了分离和纯化VBNC状态微生物的方法并分析了方法的可行性,以期为进一步探究食源性微生物VBNC状态的生理特性,研发更加快速、简便和高效的检测分离方法提供参考。     

活的非可培养状态副溶血性弧菌实时荧光逆转录PCR检测方法的建立及其毒力研究

目的 建立检测活的非可培养(VBNC)状态副溶血性弧菌的荧光逆转录PCR方法并研究其毒力基因表达.方法 将副溶血性弧菌AS079菌株添加到陈化海水中,4℃冰箱内培养,使其进入VBNC状态,针对其管家基因、鉴定基因和毒力基因分别设计实时荧光逆转录PCR引物,通过不同的PCR反应程序和引物浓度组合试验,摸索最佳反应体系条件,用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力研究.结果 用所建立的检测VBNC状态副溶血性弧菌的实时荧光逆转录PCR方法,对接种于陈化海水培养的不同时期的AS079副溶血性弧菌进行荧光定量逆转录PCR扩增,结果显示,随着培养时间的延长,毒力基因tdh2和鉴定基因toxR表达水平持续下降,但即使细菌进入VBNC状态,这两个基因也能够得到很好的扩增,说明以toxR基因和tdh2基因对进入VBNC状态的副溶血性弧菌进行检测和毒力研究方法可行.灵敏度试验表明,鉴定基因toxR的最低检测限可达到48 cfu/ml,研究毒力基因tdh2的表达需要细菌浓度至少为4.8×102cfu/ml,同时试验证明此方法与其他相近食源性致病菌无交叉反应.结论 该实时荧光逆转录PCR方法检测快速、特异性强、敏感度高,适用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力分析.     

基于Web of Science细菌活的非可培养状态研究文献的可视化分析

为全面了解有关细菌活的非可培养状态（viable but non-culturable,VBNC）研究的发展趋势,本文以1994—2021年间基于WebofScience平台核心合集数据库中836篇关于VBNC的文献作为研究对象,应用文献计量学方法,从文献的数量、发表时间、发文机构、来源出版物、研究方向和关键词多方面进行比较研究,并使用Cite Space5.8软件获得关键词知识图谱进行可视化分析。结果显示：1994—2021年期间细菌VBNC研究的年发文量呈现稳定增长趋势;836篇文献来自67个国家或地区、1 528个研究机构,分布在355种出版物中;1994—2010年和2011—2021年排名在前10位国家的发文量共占总发文量的88.04%,发文量非常集中;中国在2011—2021年期间发文量跃居世界第一;细菌VBNC研究在微生物学、传染病学、生物化学及分子生物学领域发文量始终位居前列。Escherichia coli（埃希氏大肠杆菌）、VBNC、nonculturable state（非可培养状态）、survival（存活）、resuscitation（复苏）等关键词是细菌VB...     

细菌的VBNC状态及在研究啤酒易感微生物中的探索

VBNC（viable but non-culturable）是指处于“活的但不可培养”状态的微生物体,此时微生物细胞仍具有代谢活性。但用常规方法较难或无法分离培养。VBNC作为一种生理状态．对传统微生物学产生了深远的影响,同样在改进啤酒易感微生物尤其是难培养有害菌的检测方面具有十分重要的意义。本文从形成机理、种类、最新的检测方法以及复苏过程等方面综述了VBNC状态菌的生物学特性。旨在深入了解和认识VBNC菌。从而对VBNC状态下啤酒易感微生物的检测与防控起到积极作用。     

VBNC状态啤酒易感乳杆菌的诱导及复苏

本文研究了一种典型的难培养啤酒易感乳杆菌-耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)形成"活的但不可培养"(VBNC)的诱导方式,以及从此状态复苏至可培养状态的方法。将培养至对数期的耐酸乳杆菌2011-11菌株采用啤酒内连续传代驯化法还原其在啤酒酿造过程中的实际生存状况,并通过荧光染料染色对诱导后的耐酸乳杆菌细胞进行活性检测;利用逐步升温和添加促进物法对VBNC菌进行复苏试验。当连续传代至第19代,MRS检测平板上可培养菌数降为零,此时菌体多数仍存在呈现绿色荧光的活细胞,表明耐酸乳杆菌已形成VBNC状态,且仍具有污染啤酒能力;将刚进入VBNC状态的耐酸乳杆菌菌悬液经过氧化氢酶处理后涂布于MRS平板,于26℃厌氧培养,可使耐酸乳杆菌复苏至可培养状态。本研究证实,可通过啤酒内连续传代诱导获得VBNC状态耐酸乳杆菌,而添加过氧化氢酶改良常规MRS平板是一种有效的复苏方法。     

次氯酸钠诱导肠炎沙门氏菌活的非可培养状态形成及复苏过程研究

目的 研究不同有效氯浓度次氯酸钠溶液诱导肠炎沙门氏菌进入活的非可培养状态（viable but non-culturable state: VBNC）及复苏条件研究。方法 以不同有效氯浓度次氯酸钠处理肠炎沙门氏菌,分析肠炎沙门氏菌活的非可培养状态菌数及VBNC发生率的变化,结合扫描电镜观察肠炎沙门氏菌VBNC态细胞与正常细胞的形态差异,而后比较不同复苏条件的复苏效果,同时对复苏后的细胞生理活性进行评价。结果 40 mg/L有效氯浓度处理20 min可使活菌全部进入VBNC状态,细胞表面出现褶皱塌陷;高于60 mg/L有效氯浓度可全部杀灭,细胞出现断裂、破损;进入VBNC态的肠炎沙门氏菌在5种复苏处理下,均可恢复可培养性;在20 mmol/L丙酮酸钠×热激条件下恢复效果较好。pHi和胞内ATP显示复苏后细胞活性较正常细胞有所降低。结论 在食品生产、环境清洁中应注意次氯酸钠使用浓度,否则极易造成肠炎沙门氏菌VBNC态的形成和复苏,导致食品污染,从而增加食品安全风险。     

不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。     

乳酸菌活的非可培养态的研究进展

乳酸菌在某些恶劣的环境下仍可以保持代谢活性,会失去在常规培养基上生长繁殖的能力从而进入活的非可培养态(Viable but non-culturable,VBNC)。文中阐述了目前已经发现的VBNC态乳酸菌的种类、其诱导和复苏条件、生理生化特性、检测方法及前景展望,使我们更深入地认识和了解乳酸菌的VBNC态,为今后乳酸菌在工业生产和应用过程中保持高活性状态提供新思路和新方法。     

PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养（viable but non-culturable, VBNC）状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术（propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR）能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关（R²=0.99）。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×10¹～2.90×10