烟酰胺磷酸核糖转移酶在大肠杆菌中的表达及催化合成烟酰胺单核苷酸

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合成NMN。本研究将来源Meiothermus ruber的Nampt在大肠杆菌系统进行胞内表达,表达产物经纯化后进行酶学性质分析,并进一步将其用于催化合成NMN。将重组菌株在16℃低温下进行摇瓶水平诱导21 h,收集发酵菌体并进行超声破碎,破碎后上清利用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE结果显示表达与纯化后的产物大小约55 ku,与预期的蛋白分子量相符。重组Nampt的最适反应温度为45℃,最适p H为6。酶动力学分析显示,该酶对底物NAM催化的Km、Vmax、kcat分别是0.39μmol/L、3.20μmol/(mg·min)、1.391/s。使用该酶催化生产NMN,通过反应中补加一次底物PRPP,反应10min产物NMN产量可达30 mg/L。本研究成功表达一个酶学性质和热稳定性优良的Nampt,并将其应用在单酶催化生产NMN时有较高的产量和生产效率,为生物酶法合成NMN的应用研究奠定了基础。     

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶（nicotinamideribosidekinase,NRK）和多聚磷酸酶（polyphosphatekinase,PPK）的双菌耦合发酵体系，实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株，筛选得到高活性的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L，产率77.4%；然后对NRK1的诱导表达条件进行优化，发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达；进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索，发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）浓度比1∶1.5时，NMN产量最高为5.73 g/L，产率85.78%；最后，通过对E. coli BL21(...     

大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

烟酰胺单核苷酸（NMN）是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Sfnampt）、磷酸核糖焦磷酸激酶（Tkprs）和核糖激酶（Erbks）。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37 ℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35 ℃热稳定性良好而在40~55 ℃较差;Tkprs在40~60 ℃热稳定性良好;Erbks在25~40 ℃热稳定性良好而在45 ℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65 μmol/(L•min)、2.37 μmol/(L•min)、12.58 μmol/(L•min),Km分别为2.87 μmol/L、25.48 μmol/L和74.13 μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37 ℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50 μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。     

代谢工程改造大肠杆菌发酵生产β-烟酰胺单核苷酸

为实现大肠杆菌高效生产β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN）,设计模块化代谢改造策略。首先,对烟酰胺（nicotinamide,NAM）和β-NMN支路代谢涉及的8个酶进行失活,减少底盘细胞对前体和产物的额外消耗。其次,通过引入NAM输入蛋白（Bc NiaP）、β-NMN输出蛋白（Bm PnuC）、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶（5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate?synthetase,Prs）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide?phosphoribosyl?transferase,Nampt）,敲除调节蛋白PurR,工程菌N12’摇瓶发酵可积累0.34 g/L的β-NMN;此后,比对筛选发现Comamonadaceae?bacterium来源的Nampt活性较高且对底盘细胞负担较小;通过进一步强化Bm PnuC和Prs的表达水平,工程菌N18摇瓶发酵β-NMN产量提高至1.36 g/L。最后,利用发酵罐分批补料发酵38 h,β-NMN产量达到10.2 g/L,NAM到β-NMN的摩尔转化...     

调整葡萄糖转运系统提高大肠杆菌L-苏氨酸产量

葡萄糖的有效利用是提高大肠杆菌合成L-苏氨酸能力的关键,作者通过优化葡萄糖转运来提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。利用CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌TWF001中分别敲除了PTS系统关键基因ptsH和ptsG,并在30 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵。与对照菌株TWF001相比,TWF001ΔptsH和TWF001ΔptsG合成L-苏氨酸能力均有明显改善;TWF001ΔptsH L-苏氨酸产量提升38.02%。在TWF001ΔptsH基因组上用trc启动子过表达galP基因,构建了TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP。对3株突变菌在40、50、60 g/L葡萄糖质量浓度下进行了摇瓶发酵;36 h后TWF001ΔptsH,Ptrc：：PgalP在40 g/L葡萄糖质量浓度时,L-苏氨酸产量达到26.16 g/L,糖酸转化率为0.65 g/g,L-苏氨酸产量提升幅度达42.12%。研究结果说明优化葡萄糖转运可以有效提高大肠杆菌L-苏氨酸合成能力。     

核磁共振波谱法同时定量测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体化合物

目的 建立可同时测定保健品中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)及其前体化合物含量的核磁共振波谱法。方法 采用核磁共振波谱技术，优化检测条件后，开发了标准曲线法和定量核磁共振(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)法两种定量检测方法，用于测定保健品中2种形式的NAD及其4种前体化合物。结果 确定了各目标化合物的特征峰。对于标准曲线法，6种目标化合物的线性关系良好(≥0.9999)，除烟酰胺(nicotinamide，NAM)的定量限为0.5 mmol/L外，其他5种目标化合物的定量限均为0.2 mmol/L。考察了两种具有代表性的NAD+前体化合物的日间和日内重现性，烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)和NAM的日间重现性分别为0.21%和0.37%，日内重现性分别为1.03%和1.44%。用标准曲线法和qNMR两种方法分别对收集的10个NAD+补充剂保健品进行检测，误差合理(<5%)。结论 建立的核磁共振方法具有良好的可靠性和灵敏度，可用于保健品中NAD+及其前体化合物的生产控制和市场监管。     

高效液相色谱法同时测定烟酰胺单核苷酸中5种有关物质

目的 构建同时检测烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)中5种有关物质[烟酰胺氧化物、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)及烟酰胺]含量的高效液相色谱法。方法 采用C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液(用磷酸调节pH为4.5)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,流速为1 mL/min,进样量为20μL,检测波长210 nm,柱温20℃,试样盘控温:5℃,并对方法的专属性、灵敏性、准确性、重复性、耐用性及适用性进行验证。结果 烟酰胺氧化物、ATP、ADP、AMP及烟酰胺分别在质量浓度0.4060～16.2402、0.4110～16.4403、0.4150～16.6010、0.4163～16.6507、0.4028～16.1206μg/mL范围内,质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系,线性系数r²     

添加辅酶前体及流加诱导物提高黄嘌呤氧化酶发酵产率

通过对产黄嘌呤氧化酶菌株进行16S rDNA序列分析,构建系统进化树,确定该菌株为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。添加辅酶前体(核黄素、硫胺素)及诱导物(次黄嘌呤,3.6 g/L),提高了发酵产酶;通过两种方式流加葡萄糖及次黄嘌呤,结果表明,发酵至24 h,一次性补葡萄糖质量浓度4.0 g/L,流加次黄嘌呤质量浓度至3.6 g/L,酶产率可达8 952.7 U/L,比未补料时提高25.7%,平均产率系数达1 041.0 U/g。测定流加发酵过程中铵根离子浓度变化,发现一定质量浓度的铵根离子抑制发酵产黄嘌呤氧化酶。     

2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸酶法合成工艺优化

以L-抗坏血酸和β-环糊精为底物,利用海洋微生物Y112所产的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)催化合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)。在单因素试验的基础上应用Plackett-Burman试验设计筛选出3个对AA-2G产量有显著影响的因素(pH、底物浓度、加酶量),然后应用Box-Behnken方法进行三因素三水平的试验设计优化AA-2G酶法合成工艺。结果表明,最佳工艺条件为:加酶量90.78U/g·β-环糊精,pH 9.07,底物浓度56.81g/L,底物配比11(体积比),转化时间24h,温度45℃。该条件下,AA-2G的产量为10.62g/L。     

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D--阿洛酮糖是D--果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D--阿洛酮糖 3-差向异构酶（D--psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase）能够催化D--果糖生产D--阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D--阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧（DO）、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为：DO为30%、pH 6.0、温度37 ℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为：在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/（L·h）,在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。