浓香型和酱香型大曲微生物多样性分析

大曲是中国白酒酿造过程中的糖化发酵剂,具有自然接种的特点。为探究同一酒厂浓香型和酱香型大曲微生物群落组成,分别采用传统培养和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳法（PCR-DGGE）对其微生物进行分析鉴定。传统培养法共分离鉴定出198株菌,其中浓香型大曲中24种,酱香型大曲12种。两种大曲中地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）数量占绝对优势,在浓香型大曲中优势真菌为谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri ）和米曲霉（Aspergillus oryzae）,而在酱香型大曲中,以伞状毛霉（Lichtheimia corymbifera）和多变拟青霉（Paecilomyces variotii ）居多;通过PCR-DGGE共鉴定出14种菌,两种大曲中葡萄球菌（Staphylococcus）、高温放线菌（Thermoactinomyces）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和多枝横梗霉（Lichtheimia ramosa）为优势菌。     

基于26S rRNA D1/D2区序列对不同时期大曲中酵母菌的分离与鉴定

利用大曲作为糖化发酵剂是中国传统白酒主要的工艺特点之一。大曲中的微生物组成十分丰富包括各种种类的霉菌、酵母以及细菌,这些复杂的微生物体系为白酒的发酵提供了必要的微生物、酶以及风味物质。酵母菌作为所有酒类发酵生产中必不可少的微生物,在大曲的生产过程中也起到了很重要的作用。为了探究大曲中功能微生物,本文对不同时期大曲中分离的酵母菌采用26S rRNA D1/D2区序列进行分析比对,共分离鉴定了260株酵母菌,分属于22个种。主要为Wickerhamomyces anomalus,Candida orthopsilosis,Meyerozyma guilliermondii,Pichia caribbica,Saccharomycopsis fibμLigera,Cryptococcus neoformans var.grubii,Clavispora lusitaniae,Saccharomyces cerevisiae等。对序列比对的结果进行了单链构像多样性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析,确定了它们的种间差异,并构建了M-L系统树。根据这些分离鉴定的结果初步探究出大曲生产过程中不同时期酵母菌的组成和变化规律。这些结果为进一步研究中国传统白酒的酿造微生物奠定了一定的基础。     

民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定

酿造酒的独特风味、质量与酒曲中的微生物密切相关.从选取的民间传统酒曲中主要分离得到酵母茵和根霉菌,还有少量曲霉茵等.通过对其微生物进行茵落特征、茵体形态观察和生理生化特征检测,鉴定出酵母茵有3类,分别为酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia);根霉菌有2类,分别为米根霉(Rhizopus chinensis)和华根霉(Rhizopus oryzae).     

基于内转录间隔区序列鉴定浓香型大曲发酵表面霉菌

浓香型大曲生产时曲块表面生长的霉菌很难通过形态学观察进行鉴定,为了确定大曲表面菌丝的生物学分类,该研究借助 内转录间隔区（ITS）克隆文库的构建,对大曲表面霉菌进行了分子生物学鉴定。 结果表明,曲块表面生长的菌丝体为米根霉（Rhizopus oryzae）,是一种非常重要的酿酒微生物。     

清香型小曲白酒机械化生产中微生物动态变化研究

白酒酿制是多种微生物共同发酵的过程。 为了提高清香型小曲白酒机械化酿造的酒质,采用传统分离方法和现代分子技术 对机械化酿造车间发酵过程中的酒醅优势微生物进行分离及鉴定,并对清香型小曲酒机械化酿造过程中微生物数量变化规律进行了 总结。 结果表明,酒醅微生物主要有4种酵母、6种细菌和2种霉菌,其中,酵母菌主要为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵 母（Pichia pastoris）,细菌主要为乳酸菌（Lactobacillus）和芽孢杆菌（Bacillus）,霉菌主要为米根霉（Rhizopus oryzae）。 酵母总数在发酵 第2天可以达到最大值,为108 CFU/g;细菌在第9天后繁殖较快,总数量可以增殖到107 CFU/g;霉菌在发酵第2天后逐渐降低。 微生物 的动态变化规律研究为优化发酵工艺提供了重要参考。     

赊店老酒大曲中可培养真菌的分离和鉴定

该研究采用传统分离培养方法,对赊店老酒大曲中的真菌进行分离纯化并通过形态学观察及分子生物学鉴定确定所获菌株的分类地位。结果表明,老酒大曲样品中共计分离得到45株酵母菌和103株霉菌。共鉴定出6株酵母菌,分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）及光滑假丝酵母（Candida glabrata）;酵母的优势菌属为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（相对含量71%）、光滑假丝酵母属（Candida glabrata）（相对含量11%）。共鉴定出4个霉菌属,分别为根霉属（Rhizopus）、横梗霉属（Lichtheimia）、曲霉属（Aspergillus）和毛霉属（Mucor）;霉菌的优势菌属为根霉属（Rhizopus）（相对含量37%）、横梗霉属（Lichtheimia）（相对含量33%）。     

高温大曲中微生物的分离与鉴定

采用传统分离培养方法和现代分子生物学方法,对酱香型白酒高温大曲中微生物的多样性进行研究分析。从酱香型白酒高温大曲中分离出147株微生物,其中97株为细菌,包括芽孢杆菌、放线菌、葡萄球菌、微球菌4类;50株霉菌,包括青霉、曲霉、毛霉、交链孢霉、茎点霉菌、球毛壳、散囊菌、红曲霉8类,研究结果表明,高温大曲中的微生物具有高度的多样性。     

高通量测序法对清香大曲真菌群落结构的分析

利用微生物生态学方法客观分析清香大曲真菌群落结构有利于分析大曲功能,同时明确大曲功能菌。利用高通量测序法分析了冷季和热季清香白酒生产用曲真菌群落结构。结果表明,用不同的宏基因组DNA提供试剂盒,以及不同测序区域得到较为一致的结果,清香大曲在热季和冷季的主要真菌类群相同,主要的真菌类群有霉菌和酵母,霉菌有Rhizopus oryzae(米根霉)和Lichtheimia corymbifera(伞枝犁头霉),酵母有Pichia kudriavzevii(库德毕赤酵母)和Saccharomycopsis fibuligera(扣囊复膜酵母),2种霉菌含量明显高于酵母,而且冷季酵母比例较热季明显减少。通过本实验可以确认清香大曲主要真菌类群有米根霉、伞枝犁头霉,酵母菌则比较少,主要有扣囊复膜酵母和库氏毕赤酵母。     

包装纸及纸盒霉菌分离及鉴定

参照《常见与常用真菌》及《真菌鉴定手册》对霉变的纸板、纸盒、包装盒进行霉菌分离,共分离出六种霉菌,并对分离的霉菌进行分子生物学鉴定,鉴定菌株1#为局限曲霉(Aspergillus flavus),2#为黑曲霉(Aspergillus niger),3#为烟曲霉(Aspergillus fumigates),4#为白曲霉(Aspergillus candidus),5#为产紫青霉(Penicillium purpurogenum),6#为绿色木霉(Trichoderma viride)。     

提高郫县豆瓣甜瓣子品质的工艺条件优化

以郫县豆瓣生产过程中分离到的米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）为出发菌种,以感官评价和氨基酸态氮及综合酶活力为评价指标,筛选出功能米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.1083和SICC3.930进行提高甜瓣子品质研究。通过单因素试验,筛选出混合种曲比例、发酵温度、盐分3个显著影响因素,采用响应面法优化混合种曲发酵工艺条件。结果表明,最佳发酵工艺为米曲霉SICC3.1083和SICC3.930质量比1.0∶1.0、发酵温度40 ℃、发酵时间25 d、盐分12%。在此优化工艺条件下,甜瓣子感官评分为88分,氨基酸态氮含量为0.78 g/100 g,比优化前分别提高了17%和20%,感官评分和理化指标均优于传统发酵工艺。     

白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定

以不同香型大曲为筛选源分离出霉菌96株,在透明圈法初筛、糖化力测定法复筛的基础上,以清香大曲和糖化酶为对照,模拟白酒酒精发酵过程,将酿酒酵母与霉菌纯种曲混合发酵,以出酒率作为评判指标,从中筛选出1株优质霉菌Rh-07。其纯种曲糖化力、发酵结束后培养基中酒精浓度、出酒率分别为2657.00 U/g、15.40 mL/100 g、42.73%;且以Rh-07纯种曲为糖化剂,其发酵速度基本与对照大曲一致。采用传统微生物学和现代分子生物学的方法对Rh-07进行了鉴定,初步确定为Rhizopus oryzae。同时发现,霉菌糖化酶活力大小与其在酒精发酵中的作用不成严格的正相关关系;在评价霉菌在白酒酒精发酵过程中作用时,不能单纯以糖化酶作为评价指标,应以原料与霉菌作用后的整个物系对酒精发酵作用作为评价指标。     

Complex microbiota of a Chinese "Fen" liquor fermentation starter (Fen-Daqu), revealed by culture-dependent and culture-independent methods

Daqu is a traditional fermentation starter that is used for Chinese liquor production. Although partly mechanized, its manufacturing process has remained traditional. We investigated the microbial diversity of Fen-Daqu, a starter for light-flavour liquor, using combined culture-dependent and culture-independent approaches (PCR-DGGE). A total of 190 microbial strains, comprising 109 bacteria and 81 yeasts and moulds, were isolated and identified on the basis of the sequences of their 16S rDNA (bacteria) and 26S rDNA and ITS regions (fungi). DGGE of DNA extracted from Daqu was used to complement the culture-dependent method in order to include non-culturable microbes. Both approaches revealed that Bacillus licheniformis was an abundant bacterial species, and Saccharomycopsis fibuligera, Wickerhamomyces anomalus, and Pichia kudriavzevii were the most common yeasts encountered in Fen-Daqu. Six genera of moulds (Absidia, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Rhizomucor and Penicillium) were found. The potential function of these microorganisms in starters for alcoholic fermentation is discussed. In general the culture-based findings overlapped with those obtained by DGGE by a large extent. However, Weissella cibaria, Weissella confusa, Staphylococcus saprophyticus, Enterobacter aerogenes, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus lactis, and Bacillus megaterium were only revealed by DGGE.     

强化功能菌菌种优筛及配比研究

为规范强化大曲的生产,适应西凤酒扩能及数字化生产需求,通过对强化霉菌的优筛、复壮及性能测试,获得优良的强化菌种,继而优化强化菌种的配比方案,使大曲性能更优。结果表明:(1)通过糖化力培养基筛选及菌株酶活测定,共筛选出6株强化霉菌,分别是黑曲霉M004-2、黑曲霉C556-22、酯化红曲霉-16、红曲霉C462-11、根霉S和根霉5,对其进行重新保藏;(2)对筛选出的菌株进行不同比例混合固态发酵试验,通过不同理化指标进行比较分析,得出红曲霉:黑曲霉:根霉=3:1:2的配比组合为最优组合。     

白酒大曲微生物研究进展

酒曲是中国白酒酿造必不可少的糖化、发酵和生香剂。根据制曲工艺不同,将酒曲分为大曲、小曲、红曲、麦曲、麸曲、高温曲、中温曲、低温曲等类别。我国主要名优白酒是以大曲为起酵剂。大曲中微生物菌系非常复杂,种类繁多。生香动力的细菌、糖化主力的霉菌以及酒醅发酵原动力的酵母等微生物,不断交替更迭的作用,共同维持着白酒发酵的正常进行。传统固态酿造过程中,大曲中微生物在大曲酒的品质、风味呈现方面扮演着极为重要的角色。该文依据大曲原料和制作工艺,简要介绍了大曲中微生物的来源、主要微生物类群以及各类微生物的主要功能,并在此基础上对大曲微生物和白酒酿造研究方面提出展望。     

宜宾多粮型白酒窖房空气中产糖化酶的霉菌

对分离自窖房空气中的104株霉菌产糖化酶能力进行检测,发现其中有14株具备产糖化酶能力。结合形态、特征和基于ITS nu-rDNA的系统发育分析,此14株菌分属于Aspergillus（6株）、Mucor（3株）、Penicillium（2株）、Rhizopus（1株）、Gibberella（1株）、Cladosporium（1株）6个属,Aspergillus为优势属,显示浓香型白酒窖房中空气存在多样性较为明显的产糖化酶霉菌。     

不同类型丝状真菌发酵产酶性能比较及其混菌发酵性能研究

比较了实验室前期从福建红曲黄酒酿造用曲中分离及台湾生物资源研究及保存中心(BCRC)的不同丝状真菌菌株(黑曲霉AN19、黄曲霉AF20、米曲霉AO35、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494、黄曲霉BCRC31654、米曲霉BCRC30222和米根霉BCRC32229)的产酶性能,从中筛选出产液化酶、糖化酶和蛋白酶活力较高的4株菌株:黄曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222。将此4株丝状真菌菌株分别进行单一和两两混合发酵糯米,研究其产酶及产糖性能。结果表明:接种纯种米根霉RO45到糯米培养基中,测得的液化酶活力和还原糖产量最高,然而整个发酵过程蛋白酶活力始终较低;米根霉RO45与米曲霉BCRC30222混合发酵,不仅保持较高的液化酶活力和还原糖产量,还能够显著提升发酵体系中的蛋白酶活力。本研究结果对于黄酒传统酿造工艺的改进和优良产酶菌株的筛选提供了重要的基础数据。     

浓香型大曲发酵过程中霉菌消长情况的研究

通过最佳培养基筛选培养纯化和Biolog鉴定出12株优势霉菌菌株,在培养各阶段中霉菌理化指标的变化呈一定规律性,在翻曲前一直处于增长的趋势,翻曲后开始下降.温度、湿度和水分含量是影响霉菌生长繁殖和酶活性的重要因素,但温度、湿度与霉菌菌落消长之间不显著.霉菌中的曲霉和根霉可以产生淀粉酶,其菌落的消长对淀粉含量有非常显著的相关性;经分析霉菌菌落的消长对糖化力有显著影响,糖化力和液化力的酶活性有显著的正相关性.     

宋河浓香型白酒酒醅纯培养霉菌群落的组成及功能酶筛选

为探究宋河浓香型白酒酒醅纯培养霉菌群落组成,检测纯培养菌株与酒醅发酵过程相关的功能酶酶活特征,为白酒相关功能菌株发掘与利用提供依据,本实验采用纯培养方法,对不同发酵时间、不同位置酒醅样品中的霉菌进行分离;根据形态特征去重复后进行18S rRNA基因克隆测序,初步判断其分类地位;采用点接法进行酒醅发酵相关5种功能酶筛选。结果表明,宋河浓香型白酒酒醅中蕴含丰富霉菌类群,共获得纯培养霉菌63株,形态去重复后共计15株,归属于：草本枝孢（Cladosporium herbarum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、沃特曼篮状菌（Talaromyces wortmannii）、嗜松篮状菌（Talaromyces pinophilus）、杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、米曲菌（Aspergillus oryzae）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、桔青霉（Penicillium citrinum）、菲律宾青霉（Penicillium freii）、雪白丝衣霉（Byssochlamys nivea）及两个潜在新分类单元;霉菌的纯培养检出率在宋河浓香型白酒酒醅发酵3~15 d较高,之后随发酵时间增加逐渐降低;酒醅中的纯培养霉菌菌株具有丰富的功能酶酶活特性,淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、酯化酶的酶活筛选率分别为：100%、93.3%、33.3%、73.3%、46.7%,为后续进一步研究菌株的功能及开发利用奠定基础。     

Changes in microbial community during fermentation of high‐temperature Daqu used in the production of Chinese ‘Baiyunbian’ liquor

Daqu is a fermentation starter used in the production of Chinese liquor. The present study investigated changes in the microbial community during the fermentation of Baiyunbian high‐temperature Daqu during a cycle time of 140 days. Two methods were used, a culture‐dependent method (viable cell counting) and a culture‐independent method (high‐throughput sequencing of bacterial 16S rRNA gene and fungal internal transcribed spacer region). It was found that thermotolerant microorganisms such as Bacillus , Thermomyces and Actinobacteria were dominant in all stages of Daqu fermentation, especially during the high‐temperature period of days 7–38. In the initial 110 days of fermentation, operational taxonomic units and number of bacteria were higher than those of fungi, but the opposite was observed towards the end of fermentation (day 140). In mature Daqu , the predominant bacterial species were Bacillus and unclassified Thermoactinomycetaceae, followed by Thermoactinomyces , Kroppenstedtia and Saccharopolyspora ; the predominant fungi were Aspergillus , unclassified Trichocomaceae, Thermomyces , Rhizopus , Monascus and Candida , among others. It is possible that the addition of mother Daqu , temperature and storage time played critical roles in the microbial composition of Daqu . Collectively, the above findings provide important information that can be used to optimize conditions for large‐scale production of Daqu . Copyright © 2017 The Institute of Brewing & Distilling