产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育

以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。     

原生质体融合结合基因编辑技术显著提高酿酒酵母2-苯乙醇产量

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已用于生产天然2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE),但其产量低，耐受性差。该研究筛选出3株具有不同优良性状的酿酒酵母菌株，其中菌株LSC-1的2-PE产量为3.41 g/L,菌株NGER对2-PE的耐受性达3.60 g/L,菌株S.C-1耐热性好并能在41℃下生长。以这3株菌为亲本，通过2轮原生质体融合获得融合子菌株RH2-16,对2-PE的耐受性提高了20%。以L-苯丙氨酸为底物，发酵转化36 h, 2-PE产量达到4.31 g/L,与亲本菌株LSC-1和2-PE工业生产菌株CWY132相比，分别提高26.4%和38.1%。利用CRISPR/Cas9系统，在RH2-16中构建了含突变的Ras特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子CDC25(W1416C)菌株，2-PE的产量提高了8%。在RH2-16中过表达艾氏途径合成2-PE关键基因ARO8,ARO10和ADH2未能提高2-PE产量。研究为筛选合成2-PE等天然产物的新型酿酒酵母菌株及其育种提供了一种有效策略。     

多亲本原生质体融合构建高产谷胱甘肽菌株

基于多亲本原生质体融合技术提高酿酒酵母Y518产谷胱甘肽能力。结果表明,酿酒酵母Y518培养8h,经0.15%巯基乙醇前处理,酶解(酶浓度17.5g/L)60min,原生质体形成率达90%以上;在40% PEG6000(含5g/LCaCl2)诱导下融合,融合率可达2.6×10-5;通过4轮基因组改组,得到2株GSH产量提高的突变菌株,最高可达15.92mg/g,为原始菌株的2倍。     

单亲灭活保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株融合子的选育

为获得具有抗噬菌体功能且发酵性能优良的乳酸菌酸奶生产菌株,将生产用保加利亚乳杆菌制备原生质体后高温灭活,灭活后的原生质体与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体通过PEG6000诱导进行融合,并对融合子性能进行研究。结果从20株融合子中挑选出3株具有噬菌体抗性且发酵性能优良的乳酸菌融合子。融合条件为:以PEG6000(浓度为400 g/L,添加0.01 mol/L Ca Cl2、0.02 mol/L Mg Cl2)为促融剂,40℃融合2 min。此条件下,融合率可达1.85×10-6。获得的融合子在凝乳、产酸、产粘性物质、产香气成分及抗噬菌体方面性能优越,适合于酸奶生产。     

增加ccaR基因剂量提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

CcaR蛋白对棒状链霉茵(S.clavuligerus)中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码.PCR获得包含ccaR完整基因及其上下游一定区域的扩增产物,构建重组质粒pSET152-ccaR并转化大肠杆茵ET12567/pUZ8002后,通过属间接合转移至棒状链霉菌B71-14中.pSET152含有attP位点,可以与链霉菌基因组中的attB住点特异性同源整合,将重组质粒pSET152-ccaR携带的ccaR插入到S.clavuligerusB71-14染色体中的attB位点,实现了在S.clavuligerusB71-14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得的突变株S.clavuligerusB71-14:ccaR产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54倍.     

原生质体融合选育冠菌素高产菌株

研究以抗卡那霉素突变株189(KMr、Glu+)和谷氨酸缺陷营养型突变株A4.6.727(Glu、KM8)为亲本,进行原生质体融合构建冠菌素高产菌株.确定了制备原生质体的适宜条件为溶菌酶浓度0.05mg/mL和酶解时间100min,此条件下原生质体形成率达79.1%,再生率为12.8%.所得融合子经多次转管培养,检测融合子发酵产冠菌素产量,最终筛选到一株高产冠菌素菌株S1893,其冠菌素相对产量比出发菌株提高184.1%和519.0%.     

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株,在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上,将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明,当以0.6mol/L Na Cl为高渗洗涤液,0.1mg/m L溶菌酶酶解40min后,涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上,原生质体形成率达到95.49%,再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件,融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产Subtilosin A菌株进行两轮全基因组改组,结合双亲灭活的筛选方法,挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264,产量达17.59mg/L,比出发菌株提高了3.58倍。     

增强海藻糖胞内积累提高大肠杆菌耐受性与乙醇产率

为提高产乙醇大肠杆菌对发酵底物和乙醇的耐受性,并提高乙醇发酵性能,以大肠杆菌B0013-1031H为出发菌株,对其海藻糖代谢途径进行改造,获得了敲除海藻糖分解途径的突变株JC31和进一步加强海藻糖合成途径的突变株JC41。突变株JC31和JC41较出发菌株都具有更高的海藻糖合成与积累能力,其中JC41的胞内海藻糖含量可达出发菌株的12倍。与出发菌株相比,突变株JC31和JC41对葡萄糖和乙醇胁迫的耐受性显著提高。进一步引入乙醇合成途径,在葡萄糖质量浓度120 g/L的发酵条件下,菌株JC31-PA表现出最优的发酵性能,其最大乙醇产量为50. 6 g/L,较对照菌株提高了5. 42%;乙醇转化率为48. 72 g/100 g葡萄糖,较对照提高了12. 67%,达到理论转化率的95%。     

乙酸胁迫下巴氏醋酸杆菌发酵过程中微环境水平的应答分析

以Acetobacter pasteurianus CICIM B7003及其高产突变株A. pasteurianus CICIM B7003-02为研究对象,通过2株巴氏醋酸杆菌发酵过程中胞内微环境分析来揭示其耐酸机制。在7. 5 L发酵罐中比较分批和半连续发酵过程中其发酵动力学以及和胞内微环境变化。结果显示,分批发酵中其平均产酸速率达0. 836 g/(L·h),相对亲本菌株提高29. 6%。半连续发酵中酸启动时间缩短了31 h,微环境分析表明,突变株中与产酸直接相关的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)的最高酶活分别提高27. 0%和15. 2%,辅酶Q9含量提高69. 5%。突变株拥有更高比例的十八碳烯酸,比亲本株高71. 4%。突变株最高胞内ATP含量是亲本株2. 33倍,胞内ATP与比生长速率呈正相关,胞内谷氨酸和天冬氨酸含量分别比亲本株提高10. 7%和18. 3%。突变株主要依靠加强乙醇呼吸链,增强ATP合成和关键氨基酸代谢等机制的协同作用提高酸胁迫抗性     

PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)可产生多种β-内酰胺类化合物,其中包括克拉维酸。利用聚合酶链式反应(PCR)-Targeting体系构建棒状链霉菌突变株是获得克拉维酸高产菌株的又一可行方法。采用该体系对棒状链霉菌的lat基因进行了敲除,获得了没有抗性标记的lat基因被敲除的突变株S.clavuligerus lat::scar,其克拉维酸产量是出发菌株的2.8倍。由于最终构建的突变株没有抗性标记,因此可以将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因,实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的,为链霉菌的基因突变提供了又一种有效的方法。     

基于途径分析的产甘油有孢汉逊酵母菌株的选育

以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）GF-23为出发菌株,对其甘油的合成代谢途径进行分析并提出育种策略。 对 菌株GF-23进行诱变筛选,最终得到一株耐高渗高产甘油的葡萄汁有孢汉逊酵母突变菌株GY-1。结果表明,突变菌株GY-1的耐氯化 钠质量浓度达到50 g/L,在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基中培养2 d时,甘油产量为0.44%,是出发菌株的3.33倍;接种在葡萄汁中 发酵6 d后,甘油产量达到0.49%,是出发菌株的4.45倍。 葡萄发酵液中的残糖量为3.03 g/L,酒精度为3.86%vol,说明突变菌株GY-1能 够适用于葡萄酒的发酵。 对突变菌株连续传代5次以上,其遗传性状稳定且甘油产量均无明显变化。     

嗜热链球菌M5-5冻干保护剂配方的优化

为了研究不同冻干保护剂在真空冷冻干燥过程中对嗜热链球菌M5-5菌体细胞的保护效果,采用单因素试验和正交试验,以冻干后的菌体存活率为评价指标,考察9种冻干保护剂在冷冻干燥过程中对M5-5菌体的保护效果,以期获得最优保护剂配方。结果表明,海藻糖、甘油和脱脂乳作为单一冻干保护剂时,菌体细胞存活率分别为43.85%、47.51%和40.86%,显著高于其他6种保护剂（P＜0.05）;通过正交试验确定冻干保护剂的最优配方为海藻糖60 g/L、谷氨酸钠20 g/L、甘油20 g/L、脱脂乳150 g/L,此时嗜热链球菌M5-5的冻干存活率可达88.41%。扫描电镜结果显示,添加保护剂配方组菌体细胞完整,表面光滑,说明该保护剂配方能有效减少冷冻干燥过程对菌体细胞的损伤。     

claR基因的扩增对棒状链霉菌棒酸合成的影响

从棒状链霉菌中克隆对克拉维酸具有正调控作用的基因claR。构建了claR的重组质粒pSET152-claR,通过接合转移将重组质粒pSET152-claR转入了野生型S.clavuligerus中,通过pSET152-claR中的attP位点整个质粒插入到S.clavuligerus基因组中的attB位点,实现了S.clavuligerus基因组DNA中增加一个拷贝claR基因的目的,所得突变株S.clavuligerus∷claR通过发酵培养,HPLC检测克拉维酸产量为原产量的1.86倍。     

明胶废水中耐钙菌株的筛选鉴定及培养条件优化

从明胶加工废水样品中筛选对Ca2+具有抗性的微生物菌株,结合形态特征、生理生化试验和分子生物学技术对其进行鉴定,并利用单因素试验及响应面法优化其培养条件,以期为高钙污染水体的微生物修复提供菌株资源和应用技术参考。结果表明,当Ca2+含量达到50 mg/mL时,从四个样品中筛选出1株抗钙性能较好的菌株,命名为N3-1,经鉴定其为尼阿布芽孢杆菌（Bacillus niabensis）。菌株N3-1生长的最佳培养条件为：初始Ca2+含量1.40 mg/L、培养温度37 ℃、培养基初始pH值8.3,培养时间21 h。在此优化条件下,菌悬液OD600 nm值为0.768。     

高产Monacolin K红曲霉菌种的筛选及液态发酵条件优化

为了提高红曲霉（Monascus ）液态发酵生产Monacolin K的能力,一种新型的常压室温等离子体（ARTP）诱变技术被应用于产Monacolin K红曲霉菌株的诱变选育工作;同时,通过构巢曲霉（Aspergillus nidulans ）平板对峙培养的筛选方法,选育获得较初始红曲霉菌Monacolin K产量提高60%以上的突变菌株MP60-6。确定发酵培养基组成为甘油5%,米粉50 g/L,蛋白胨15 g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4 1 g/L,ZnSO4 2 g/L,KH2PO4 1.5 g/L,并进一步确定在发酵第3、第4天添加0.1%的乙酸和0.2%的柠檬酸,发酵第8天补加10%的甘油。在上述条件下发酵17 d后Monacolin K产量可以达到1 302 mg/L,为出发菌株产量的2.66倍。     

耐酸性布拉氏酵母的筛选及高密度培养条件优化

布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是临床上作为益生菌药物治疗肠道疾病使用的唯一一株酵母菌,作为微生态制剂,要保证其生物效果,必须能够在胃肠道中保持一定的活菌数,研究发现影响布拉氏酵母菌在胃肠道中存活的最主要因素是低pH,为提高布拉氏酵母菌在低pH条件下的存活率,该研究采用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术对S. boulardii 进行诱变,最终筛选出3株对低pH值耐受性较好的突变株。对突变株耐低pH稳定性的研究结果表明,在传代20次后,突变株YB-3具有较好的遗传稳定性,其存活率为51.79%。在5 L发酵罐中,对突变株YB-3高密度培养条件进行优化,最终所得布拉氏酵母菌体干质量为58.79 g/L,比原始菌株提高了55.52%。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１6）07-0015-05 doi:     

Ethylene Oxide Resistance of Microorganisms Important in Spoilage of Acid and High-Acid Foods

SUMMARY: Resistance values were determined for spores of Bacillus coagulans (var. thermoacidurans), conidiospores of Aspergillus niger , vegetative cells of Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Hansenula anomala and Saccharomyces cerevisiae (var. tetrasporus) exposed to a mixture of ethylene oxide (12%)and dichlorodifluoromethane (88%). Exposures were made of organisms deposited on glass and paper discs at 33% relative humidity, 30°C and a pressure to give 700 mg per liter of ethylene oxide. Spores of B. coagulans were also exposed at 40°, 50° and 60°C. The resistance parameter D was determined to characterize the resistance of each organism displaying logarithmic death. Values of z were determined for spores of B. coagulans. The most resistant organism was B. coagulans. The spores of this organism were approximately 1.8 to 8 times more resistant than the vegetative cells of L. mesenteroides or L. brevis. Vegetative cells of H. anomala, S. cerevisiae and conidiospores of A. niger displayed nonlogarithmic death. A. niger was the most resistant of the three.     

不同熟化处理方式及多酚类物质对马铃薯全粉消化特性的影响

为开发一种低血糖生成指数(glycemic index,GI)的马铃薯产品,采用直接冷藏处理12、24、48 h及超声结合冷藏处理12 h等4种不同熟化处理方式制备马铃薯全粉,以抗性淀粉的含量为判断指标,筛选出抗性淀粉含量最高的马铃薯全粉;选用原花青素、茶多酚、绿原酸3种多酚,与马铃薯全粉共孵育,得到多酚马铃薯复合粉,采用4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-indole-D-glucopyranoside,pNPG)法测定其对α-葡萄糖苷酶抑制作用,并通过体外消化法测定多酚对马铃薯全粉消化特性的影响。结果表明:熟化后冷藏处理24 h的马铃薯全粉抗性淀粉含量最高,为4.32%,是未处理马铃薯全粉中抗性淀粉含量的2.1倍;原花青素-马铃薯复合粉对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强,其半抑制浓度(IC50)为26.35 mg/mL,与对照组相比,抑制作用增加19.14%;体外消化试验中,与对照组样品GI值94.4相比,原花青素-马铃薯复合粉GI值最低,为52,属于低GI产品。该研究对于低GI马铃薯产品的开发具有重要指导意义。     

外源物质对新疆紫草毛状根次生代谢产物含量的影响

目的：探讨不同外源物质对新疆紫草毛状根中次生代谢产物含量的影响。方法：采用分光光度法测定AgNO3、L-苯丙氨酸、乙酸钠影响下新疆紫草毛状根提取物中次生代谢产物的含量。结果：AgNO3质量浓度为5 mg/L时,毛状根中紫草素、总多酚及总黄酮的含量分别较对照提高了5、0.3 倍和0.8 倍,而花青素的含量在AgNO3质量浓度为3 mg/L时达峰值,较对照提高了0.4 倍。在AgNO3质量浓度为5 mg/L前提下,L-苯丙氨酸质量浓度为25 mg/L时,紫草素、花青素及总黄酮的含量均达峰值,分别较对照提高了0.3、1.4 倍和1.2 倍。而总多酚含量虽然并未高于对照组,但是在各个处理中仍然含量最高。在AgNO3、L-苯丙氨酸质量浓度分别为5、25 mg/L时,总多酚和紫草素含量均在乙酸钠质量浓度为50 mg/L时达到最高,花青素的含量在乙酸钠质量浓度为200 mg/L时达到最高,而乙酸钠不同处理的毛状根中总黄酮含量均明显低于对照。结论：外施一定质量浓度的诱导子AgNO3及AgNO3和L-苯丙氨酸的联合作用均能促进新疆紫草毛状根次生代谢产物的积累;外施一定质量浓度的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸钠可协同促进毛状根中总多酚、花青素和紫草素的积累,但显著抑制总黄酮的合成积累。