对虾原肌球蛋白致敏小鼠模型的构建及乳酸菌肠黏膜免疫效应对致敏性的影响

以原肌球蛋白（tropomyosin,TM）为主要过敏原,腹腔注射6 周龄BALB/c雌、雄小鼠,从第14天开始给治疗组小鼠口服灌胃长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp.）1.2202或芽孢乳酸菌09.712（Bacillus coagulans 09.712）,连续灌胃20 d。根据小鼠腹泻情况、过敏症状评分、血清中组胺（histamine,HIS）质量浓度、TM特异性免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）E水平变化构建TM致敏及益生菌治疗小鼠模型;通过氯乙酸萘酚酯酶染色、高碘酸希夫试剂特殊染色法检测各组小鼠肠道部位的肥大细胞和杯状细胞,通过免疫组化法检测各组小鼠肠道部位的CD4＋ T细胞和嗜酸性粒细胞;探究肠黏膜免疫在TM致敏及益生菌缓解TM致敏作用中的机理。结果表明：雌性小鼠更适用于构建TM致敏模型;益生菌灌胃可以通过降低血清中HIS质量浓度和IgE水平缓解肠黏膜免疫反应,减轻TM过敏症状。本研究从肠黏膜免疫反应角度探究了其在TM致敏中的作用,为食物过敏的研究提供参考。     

对虾原肌球蛋白不同致敏途径对BALB/c小鼠致敏性的影响

随着食物过敏现象的日益普遍,其已成为工业化国家一个严重的公众健康问题。食物蛋白致敏机理的相关 研究大多借助于两大类小鼠模型,即口服致敏模型和局部或皮肤致敏模型。然而,不同模型之间的差异以及如何选 择合适的模型进行研究却鲜有人关注。鉴于此,本研究旨在通过比较对虾原肌球蛋白口服灌胃和腹腔注射两种给药 途径对BALB/c小鼠致敏性的影响,寻求最佳给药方式,以便建立有效的动物模型,并在分子及免疫水平研究其致 敏机理,从而为食物过敏原动物模型的构建提供一定的理论依据,也为研究食物过敏原致敏机制以及预防治疗食物 过敏提供重要的模型依据。结果表明,腹腔注射小鼠血清中特异性免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）E、组胺以及 辅助性T细胞（helper T cells,Th）2型细胞因子含量均高于口服灌胃小鼠,其致敏性更好。此外,口服灌胃小鼠血 清特异性IgG2a、干扰素-γ、调节性T细胞水平增加,表明虽有黏膜佐剂作用,但口服给药仍可能使小鼠产生口服免 疫耐受,从而降低对虾原肌球蛋白对其的致敏性。本研究表明,腹腔注射原肌球蛋白比口服灌胃更易使小鼠致敏, 其Th1/Th2平衡被打破,Th2反应占据优势,更适合用于构建食物致敏动物模型。     

中国对虾蛋白致敏小鼠模型构建及主要过敏原的双向电泳联合质谱鉴定

目的:构建中国对虾蛋白致敏小鼠模型并研究关键过敏原。方法:采用液氮研磨结合裂解液裂解对虾肌肉提取蛋白浸出液,用不同剂量的中国对虾蛋白和弗氏佐剂的混合液腹腔注射诱发ICR小鼠致敏,采用间接ELISA方法检测小鼠血清中过敏原特异性IgE和IgG1水平在激发期不同时间点的变化,并观察致敏小鼠行为评分,建立动物致敏模型;利用双向电泳分离虾蛋白,并与阳性血清免疫印迹,从而通过质谱分析其主要过敏原。结果:3组不同剂量的虾蛋白浸出液都能使小鼠出现不同程度的过敏症状,且剂量越高过敏反应越显著;其中,高剂量组(1.0 mg)小鼠血清特异性IgE和IgG1抗体含量显著升高(P0.05),出现瘙痒、嘴角红肿等现象,过敏症状最显著。通过双向电泳联合质谱鉴定发现,能与阳性血清反应的蛋白有两种,一种蛋白分子质量为40.2ku,等电点分别为6.0和6.2,经比对为精氨酸激酶;另一种蛋白分子质量为35.8 ku,其等电点为4.6,经比对为原肌球蛋白,通过Mascot数据库分析比较得到这两种蛋白质的氨基酸序列。结论:中国对虾蛋白可引起小鼠过敏反应,其主要过敏原为原肌球蛋白和精氨酸激酶,其中精氨酸激酶可能存在不同蛋白质修饰的两种形式。     

食物过敏原重组蛋白的研究进展

食物过敏原蛋白单一组分的品质是制约食物过敏研究的关键因素之一。通过大肠杆菌、酵母表达系统生产出的过敏原重组蛋白,具有产量高、纯度高、均一性好等优点,已在过敏原蛋白标准物质的制备、食物过敏原的检测、低致敏性蛋白的生产以及其他基础研究等方面得到了具体的应用。食物过敏原重组蛋白作为天然过敏原提取物的替代物显示了巨大的发展潜力。总之,DNA重组技术是制备高品质过敏原蛋白的一条崭新途径。     

食物过敏原标准物质的研究进展

食物过敏原标准物质是解决食物过敏问题的关键实验材料之一。在食物过敏原标准化方面,鸡蛋、牛奶和花生过敏原的分离纯化、结构和免疫学性质表征方面取得了良好的效果,为研发单个过敏原蛋白标准物质提供了支撑。在美国国家标准与技术研究院（NIST）颁布的8种过敏性食物标准物质中,只有RM8445用于检测食物过敏原;由欧盟资助的两大项目中,EuroPrevall项目主要构建了一个食物过敏原信息的数据库,而CREATE项目则首次证实重组花粉过敏原rBetv1可作为天然花粉过敏原Betv1的候选标准物质,为开发重组食物过敏原标准物质提供了一种可借鉴的策略。总之,研发食物过敏原致敏性蛋白标准物质是一项重要的任务,极具挑战性。     

牛乳β-乳球蛋白过敏原表位及其潜在应用

过敏原表位是过敏原直接参与免疫反应的物质基础, 也是导致过敏反应的“元凶”。牛乳β-乳球蛋白是lipocalin家族的代表和常用模式蛋白, 它的表位信息比较完整, 拥有7个人血清IgE和6个IgG的线性表位、3个IgE结合的构象性表位以及7个T细胞表位。另外, 它的动物源血清IgE、IgG和T细胞表位也在不断被发现。牛乳β-乳球蛋白的表位信息为基于表位的应用提供了重要的支撑, 它们的应用主要涉及到预测食物过敏原的致敏性, 食物过敏的交叉反应, 食物过敏的诊断, 食物过敏的免疫治疗以及食物过敏原的检测等5个方面。     

食物口服免疫耐受中调节性T细胞及其影响因素研究进展

食物过敏反应大致可分为致敏、激发和效应三个阶段。在致敏阶段,食品中的过敏原透过肠道黏膜免疫屏障,经抗原递呈细胞处理、T细胞活化等步骤,诱导机体产生特异性IgE并结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面;在激发和效应阶段,过敏原与IgE发生桥联反应,介导组胺、白三烯等免疫介质释放,它们与效应器官上的相应受体结合,会引起局部或全身过敏反应。食物过敏发生的根本原因是部分个体对特定过敏原口服免疫耐受的破坏,而诱导建立和重建口服免疫耐受是应对食物过敏较有前景的方法,或可突破该病目前尚无有效治愈方法的瓶颈。本文就口服免疫耐受建立和重建中起核心作用的调节性T细胞以及其密切相关因素如树突状细胞、调节性B细胞、肠道菌群及其代谢产物进行综述,以期为食物过敏的防治工作提供帮助。     

克氏原螯虾过敏小鼠动物模型的构建研究

为了更好地研究食用克氏原螯虾引发的食物过敏情况,利用Balb/c小鼠构建了食物过敏动物模型,提取克氏原螯虾过敏原蛋白,采用皮下注射致敏方法,考察致敏相关的效应因子组胺含量和致敏IgE抗体产生情况,并测定致敏过程中的细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的含量,结合生理性状观察,对模型质量进行评价,结果表明,经注射致敏后,小鼠产生较多的特异性IgE抗体,血清中组胺含量也大量产生,与之相关的效应因子IL-4和IL-6均显著提高,而同时IFN-γ的含量明显减少。该研究为进一步开展克氏原螯虾食用过敏的研究提供帮助。     

花生过敏原Ara h 1蛋白的原核表达及致敏性分析

从花生中提取总RNA,用反转录聚合酶链式反应得到花生过敏原Ara h 1基因,构建pET-28a-Ara h 1表达载体,转入Rosetta（DE3）宿主表达菌中诱导产物表达,用镍离子亲和层析法纯化得到目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示目的蛋白分子质量约为75 kDa,与预计相符;经质谱鉴定为Ara h 1蛋白。用BALB/c小鼠模型评价重组Ara h 1蛋白的致敏性结果显示,重组Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、Th2型细胞因子、组胺含量升高,空肠和肺组织发生病变,表明重组Ara h 1蛋白可以导致小鼠发生Th2型过敏反应,且有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性。同时RBL细胞模型结果显示重组Ara h 1蛋白还可导致RBL细胞脱颗粒,释放β-己糖苷酶,进一步表明重组Ara h 1蛋白具有致敏性。     

BALB/c小鼠动物模型评价食物过敏性的可行性研究

目的:动物模型对于模拟人体食物过敏的可能性以及用来评价食品致敏性的可行性一直存在争议。本研究中使用BALB/c小鼠研究了其作为食物过敏动物模型的可行性,并对几种食物中蛋白的致敏性进行评价。方法:选择大豆球蛋白、卵清白蛋白、马铃薯碱性磷酸酶作为受试物,对各蛋白进行BALB/c小鼠模型研究,模拟胃液消化试验和生物信息学分析。取3~4周龄雌性BALB/c小鼠,经口给予蛋白诱发致敏。大刺激后,测定动物血浆中组胺水平,血清中特异性Ig E、Ig G1水平,m MCP-1水平和肠道渗透性,并对主要脏器进行病理组织学观察。结果:给予BALB/c小鼠一次经口致敏各蛋白,各组间特异性抗体Ig E、Ig G1水平、m MCP-1水平、组胺水平以及白蛋白水平均未表现出明显差异;而给BALB/c小鼠多次接触过敏原时,特异性抗体Ig E、Ig G1水平、组胺以及白蛋白水平都有显著性升高,产生明显的Th2型免疫反应,且BALB/c小鼠能区分这些蛋白的致敏性,即大豆球蛋白卵清白蛋白马铃薯碱性磷酸酶。模拟胃液消化试验也验证了动物试验对受试蛋白致敏性的分析结果。通过生物信息学对抗原指数分析,同样发现大豆球蛋白致敏性显著高于卵清白蛋白和马铃薯碱性磷酸酶。结论:BALB/c小鼠用于研究食品过敏原中的大豆球蛋白、卵清白蛋白、马铃薯碱性磷酸酶的致敏性是可行的,能够区分这些食物蛋白的致敏性。     

An adjuvant-free mouse model to evaluate the allergenicity of milk whey protein

Milk allergy is the most common type of food allergy in humans with the potential for fatality. An adjuvant-free mouse model would be highly desirable as a preclinical research tool to develop novel hypoallergenic or nonallergenic milk products. Here we describe an adjuvant-free mouse model of milk allergy that uses transdermal sensitization followed by oral challenge with milk protein. Groups of BALB/c mice were exposed to milk whey protein via a transdermal route, without adjuvant. Systemic IgG1 and IgE antibody responses to transdermal exposure as well as systemic anaphylaxis and hypothermia response to oral protein challenge were studied. Transdermal exposure resulted in a time- and dose-dependent induction of significant IgE and IgG1 antibody responses. Furthermore, oral challenge of sensitized mice resulted in significant clinical symptoms of systemic anaphylaxis within 1 h and significant hypothermia at 30 min postchallenge. To study the underlying mechanism, we examined allergen-driven spleen cell T-helper 2 cytokine (IL-4) responses. There was a robust dose- and time-dependent activation of memory IL-4 responses in allergic mice but not in healthy control mice. These data demonstrate for the first time a novel transdermal sensitization followed by oral challenge mouse model of milk allergy that does not use adjuvant. It is expected that this model may be used not only to study mechanisms of milk allergy, but also to evaluate novel milk products for allergenic potential and aid in the production of hypo- or nonallergenic milk products.     

玉米中的过敏原及物理加工对食品致敏性的影响研究进展

随着食用玉米的人群越来越广泛,玉米过敏问题日渐凸显。对玉米过敏的有效防御被人们所重视,加工通过改变过敏原的蛋白结构可以使过敏原致敏性降低。其中食品加工对过敏原致敏性的研究主要集中在热处理方面;然而各种非热方法,如微波、超高压等食品加工新技术,在降低食品的致敏性方面也有广阔的应用前景。相比来说非热方法通常是有利的,它们能够保留在热处理过程中经常改变的感官特性,如营养成分和风味。本文综述了玉米过敏原研究现状,总结了玉米中的过敏原,描述了对食物进行热处理和非热处理在改变食物过敏原反应性方面的作用,并且提出多种加工方式联合使用来降低玉米过敏原致敏性的未来研究方向,为玉米过敏的防御提供参考。     

主要坚果类过敏原致敏机理的初步探讨

本文以坚果过敏蛋白为抗原,构建小鼠动物致敏免疫模型,探讨坚果过敏原的致敏机理,为坚果类食物安全评价和安全开发提供有效的实验依据。选取六种坚果为原料,以昆明小鼠为受试小鼠,坚果蛋白液以0.01 mg/g进行灌胃致敏,第33 d和34 d以0.02 mg/g激发致敏,通过测定小鼠血清IgE、IgG、腹腔肥大细胞及类胰蛋白酶和血象指标,研究其病理特征。结果表明,致敏激发后小鼠IgE与IgG最高水平为0.91和0.93,组胺释放率阳性组为58%,中剂量组为40%,高剂量组为55%;小鼠腹腔肥大细胞体外激发后脱颗粒高剂量组最多以及类胰蛋白酶活性也最高;中和高剂量组、阳性组白细胞数较高(9.7±6.1、9.6±2.4、9.2±2)×109/L,低剂量组、中剂量组和高剂量组的血小板数依次降低。说明致敏后小鼠凝血功能显著减弱,免疫系统受到侵袭,体内诱发产生IgE抗体,并启动过敏介质的释放机制,导致过敏反应Ⅰ型变态反应的发生。     

Prophylactic effect of Lactobacillus oral vaccine expressing a Japanese cedar pollen allergen

Lactic acid bacteria (LAB) represent an attractive delivery vehicle for oral allergy vaccine because of their safety as a food microorganism as well as their potent adjuvant activity triggering anti-allergic immune response. Here, we report the generation of recombinant LAB expressing a major Japanese cedar pollen allergen Cry j 1 (Cry j 1-LAB), and their prophylactic effect in vivo. To facilitate heterologous expression, the codon usage in the Cry j 1 gene was optimized for the host LAB strain Lactobacillus plantarum by the recursive PCR-based exhaustive site-directed mutagenesis. Use of the codon-optimized Cry j 1 cDNA and a lactate dehydrogenase gene fusion system led to a successful production of recombinant Cry j 1 in L. plantarum NCL21. We also found that oral vaccination with the Cry j 1-LAB suppressed allergen-specific IgE response and nasal symptoms in a murine model of cedar pollinosis.     

The anti‐allergenic properties of milk kefir and soymilk kefir and their beneficial effects on the intestinal microflora

Food allergy is now recognized as a worldwide problem, and like other atopic disorders its incidence appears to be increasing. Kefir is reported to possess the ability to reduce intestinal permeation of food antigens; however, no experimental study has clearly evaluated the relationships between kefir consumption, allergen‐specific IgE response, and intestinal microflora. The aim of this study was to evaluate the effect of oral consumption of milk kefir and soymilk kefir on in vivo IgE and IgG1 production induced by ovalbumin (OVA) in mice. The effects of kefir administration on the murine intestinal microflora were also examined. Oral administration of milk kefir and soymilk kefir for 28 days significantly increased the fecal populations of bifidobacteria and lactobacilli, while it significantly decreased those of Clostridium perfringens. Milk kefir and soymilk kefir also significantly decreased the serum OVA‐specific IgE and IgG1 levels for both groups, but not those of the IgG2a analogues. Consumption of milk kefir and soymilk kefir suppressed the IgE and IgG1 responses and altered the intestinal microflora in our supplemented group, suggesting that milk kefir and soymilk kefir may be considered among the more promising food components in terms of preventing food allergy and enhancement of mucosal resistance to gastrointestinal pathogen infection. Copyright © 2006 Society of Chemical Industry     

水产品致敏蛋白的研究进展

水产品因营养丰富、味道鲜美而深受消费者喜爱,但水产品也是容易引起食物过敏反应的一类食品。目前, 全球水产品的加工难以满足过敏人群对食用安全性的需求,且针对水产品过敏的治疗,也尚无特效药物。因此,食用水产品能危害潜在过敏人群的健康,降低其生活水平。近年来,随着全球过敏发病率的上升,水产品致敏蛋白的研究已成为全球关注的公共卫生问题之一。本文介绍了水产品中的钙结合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、血蓝蛋白等主要致敏蛋白的生化特性及其抗原表位,阐述了基于致敏蛋白及其DNA为基础的酶联免疫吸附法、质谱法、生物传感器法、聚合酶链式反应检测水产品致敏蛋白的方法,同时介绍了利用物理、化学和生物方法消减致敏蛋白致敏性的研究现状,在此基础上提出了水产品致敏蛋白研究和应用中存在的问题及其发展趋势,旨为进一步认识水产品致敏蛋白,开发低致敏或无致敏性水产食品提供参考。     

Impact of dietary factors and food processing on food allergy

Allergic reactions to food can significantly reduce the quality of life and even result in life‐threatening complications. In addition, the prevalence of food allergy has increased in the last decades in industrialized countries and the mechanisms underlying (increased) sensitization are still not fully understood. It is believed that the development and maintenance of oral tolerance to food antigens is a process actively mediated by the immune system and that this reaction is essential to inhibit sensitization. Ongoing research indicates that different dietary factors also may contribute to immune homeostasis and oral tolerance to food and that food processing modulates allergenicity. One of the major questions in food allergy research is therefore which impact nutrition and food processing may have on allergenicity of food and perhaps on sensitization. We summarize in this review the different dietary factors that are believed to contribute to induction of oral tolerance and discuss the underlying mechanisms. In addition, the functional consequences of allergen modification will be emphasized in the second part as severity of allergic reactions and perhaps sensitization to food is influenced by structural modifications of food allergens.