具有缓解对虾原肌球蛋白致敏性乳酸菌的筛选及其免疫调节作用

目的:通过体外实验比较5种乳酸菌对致敏肥大细胞模型组胺释放量、脱颗粒的影响,筛选具有最佳抗过敏作用的乳酸菌;体内检测最佳抗过敏作用芽孢乳酸菌09.712对致敏小鼠血清中特异性抗体、脾脏T淋巴细胞亚群等的影响,探讨其缓解过敏的免疫调节作用机理。方法:体外构建P815肥大细胞致敏模型,与芽孢乳酸菌09.712共培养,采用ELISA测定细胞上清液中组胺含量,甲基红染色观察肥大细胞脱颗粒数,筛选最佳抗过敏乳酸菌。建立小鼠虾原肌球蛋白致敏模型,芽孢乳酸菌09.712灌胃处理,ELISA法测定小鼠血清中特异性抗体和细胞上清液细胞因子分泌水平,流式细胞术检测T细胞亚群,荧光定量PCR检测相关细胞因子和转录因子m RNA表达量。结果:比较5种乳酸菌,芽孢乳酸菌09.712可有效降低组胺含量,抑制肥大细胞脱颗粒,具有显著的抗过敏作用。体内试验表明,芽孢乳酸菌09.712处理组小鼠的过敏症状减弱,Th1/Th2、Treg/Th2比值显著高于致敏组小鼠(P0.05),且Th1型细胞因子IFN-γ分泌量增高,Th2型细胞因子IL-4、IL-13分泌量降低,血清中特异性抗体Ig E和Ig G1水平显著低于致敏组小鼠。此外,芽孢乳酸菌09.712还显著增加Foxp3、TGF-β和IL-10的m RNA表达水平(P0.001)。结论 :芽孢乳酸菌09.712能有效缓解小鼠过敏症状,其作用与促进初始T细胞向Th1和调节性T细胞(Treg)分化以及调控Treg平衡Th1/Th2有关。     

融合型原肌球蛋白MBP-CTB-TM构建及其口服致敏性评价

将麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein,MBP）、霍乱毒素B亚基（cholera toxin B subunit,CTB）以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因重组构建MBP-CTB-EGFP并原核表达纯化,利用HEK293T细胞模型探究MBP-CTB-EGFP穿透细胞膜的能力,从而开发新型黏膜佐剂。进一步地,利用原肌球蛋白（tropomyosin,TM）重组融合蛋白MBP-CTB-TM,将其应用于Balb/c小鼠致敏实验,探究融合蛋白的致敏性及其对小鼠食物过敏相关免疫反应的影响,以达到降低过敏原剂量提高建模效率的效果。结果表明：MBP-CTB-EGFP具有作为黏膜佐剂的能力,从而促进外源蛋白进入HEK293T细胞内,且与转染方式相比,携带外源蛋白进入细胞的效率更高。另一方面,利用融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠,TM特异性IgE的OD450 nm达到0.4,而天然TM致敏组仅为0.05,此外融合蛋白致敏还导致高水平的TM特异性IgG1、IgG2a产生。本研究表明,融合蛋白MBP-CTB-TM致敏效果更好,有可能达到降低过敏原用量的效果,为后续食物过敏研究提供了有力工具。     

无佐剂卵清蛋白致敏BALB/c小鼠的肠道菌群变化

研究无佐剂条件下卵清蛋白（ovalbumin,OVA）致敏BALB/c小鼠的肠道菌群变化,挖掘与OVA过敏关联的特征肠道菌群。构建OVA致敏小鼠模型,采用过敏症状评分、血清免疫球蛋白E (immunoglobulin E,IgE)水平检测及结肠组织形态学观察评估小鼠过敏反应。通过16S rRNA扩增子测序法进行肠道菌群分析,包括多样性分析、物种组成分析和功能预测。结果表明,OVA致敏组过敏症状评分、血清总IgE、OVA特异性IgE及结肠组织HE染色结果均出现显著变化,表明模型构建成功。肠道菌群分析结果显示：致敏组菌科水平的Pseudomonadaceae丰度显著上升,Lachnospirales-Lachnospiraceae与Desulfovibrionales-Desulfovibrionaceae丰度显著下降;菌属水平的Pseudomonas丰度显著上升,Lachnospiraceae NK4A136 group丰度显著下降,推测Bacteroidales可作为OVA过敏的特征菌群。     

虾制品致敏性诱发豚鼠相关细胞因子及Th1/Th2细胞平衡的变化

以消减致敏性南美白对虾的虾仁、虾肉和虾蛋白为样品,以pH 7.5的磷酸盐缓冲液为阴性对照,未处理的虾蛋白为阳性对照,建立豚鼠过敏模型,研究过敏豚鼠血清中相关细胞因子与食物过敏的相关性,并推断食物过敏对辅助性T（type 1/type 2 T-helper, Th1/Th2）细胞平衡的影响。收集过敏豚鼠的血清,采用酶联免疫吸附测定法检测血清中免疫球蛋白E（immunoglobulin E,IgE）、组胺（histamine,HIS）、相关细胞因子（白细胞介素（interleukin,IL）-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）质量浓度。结果表明,用未处理的虾蛋白致敏豚鼠,用致敏性消减程度不同的虾制品（虾蛋白、虾肉、虾仁）提取的蛋白激发,消减致敏性的虾蛋白、虾肉和虾仁提取蛋白激发后豚鼠血清中IgE含量分别为（3.905±0.120）、（4.813±0.188）、（5.199±0.327）U/mL,HIS质量浓度分别为（16.437±1.120）、（19.656±1.080）、（21.071±1.732）μg/mL,激发后血清中IgE和HIS质量浓度变化与致敏性程度呈正相关,致敏性越低,血清中IgE和HIS质量浓度越低。过敏豚鼠血清中IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α质量浓度的变化与虾制品致敏程度呈正相关;同时,与IgE和HIS质量浓度变化规律具有一致性;血清中IL-10质量浓度变化与致敏性程度呈负相关;因此,这些细胞因子与食物过敏具有很好的相关性。过敏血清中IFN-γ没有呈现规律性变化,但IFN-γ/IL-4随着致敏性的增强而减小。因此,推测虾制品激发过敏豚鼠的Th1/Th2细胞平衡向Th2细胞偏移。     

对虾原肌球蛋白不同致敏途径对BALB/c小鼠致敏性的影响

随着食物过敏现象的日益普遍,其已成为工业化国家一个严重的公众健康问题。食物蛋白致敏机理的相关 研究大多借助于两大类小鼠模型,即口服致敏模型和局部或皮肤致敏模型。然而,不同模型之间的差异以及如何选 择合适的模型进行研究却鲜有人关注。鉴于此,本研究旨在通过比较对虾原肌球蛋白口服灌胃和腹腔注射两种给药 途径对BALB/c小鼠致敏性的影响,寻求最佳给药方式,以便建立有效的动物模型,并在分子及免疫水平研究其致 敏机理,从而为食物过敏原动物模型的构建提供一定的理论依据,也为研究食物过敏原致敏机制以及预防治疗食物 过敏提供重要的模型依据。结果表明,腹腔注射小鼠血清中特异性免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）E、组胺以及 辅助性T细胞（helper T cells,Th）2型细胞因子含量均高于口服灌胃小鼠,其致敏性更好。此外,口服灌胃小鼠血 清特异性IgG2a、干扰素-γ、调节性T细胞水平增加,表明虽有黏膜佐剂作用,但口服给药仍可能使小鼠产生口服免 疫耐受,从而降低对虾原肌球蛋白对其的致敏性。本研究表明,腹腔注射原肌球蛋白比口服灌胃更易使小鼠致敏, 其Th1/Th2平衡被打破,Th2反应占据优势,更适合用于构建食物致敏动物模型。     

嗜酸乳杆菌缓解牛乳过敏的研究

目的:观察嗜酸乳杆菌对牛乳β-乳球蛋白(β-Lg)过敏小鼠血清抗体水平、肠道菌群结构及肠道短链脂肪酸代谢的影响,研究其缓解过敏的机制。方法:BALB/c小鼠被随机分成空白组、过敏组和不同浓度嗜酸乳杆菌组(n=6)。致敏组小鼠每周1次腹腔注射0.2 m L 1 mg/m L的β-Lg,共3次;嗜酸乳杆菌组小鼠在腹腔注射过敏原前1周灌胃小鼠低、中高浓度的菌悬液,3次/周;空白组同时灌胃生理盐水。造模结束后取小鼠血液和结肠粪便备用。采用酶联免疫法检测各组小鼠血清中总Ig E抗体水平,气相色谱法分析各组小鼠结肠粪便中短链脂肪酸代谢变化,选择性培养基计数结肠粪便中肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌。结果:嗜酸乳杆菌干预可有效改善小鼠的β-Lg过敏症状,抑制血清的总Ig E水平。与致敏组比较,不同浓度嗜酸乳杆菌组小鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显回升(P0.05),肠道短链脂肪酸如丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸水平显著提高(P0.05),特别是高剂量嗜酸乳杆菌的效果显著,与空白组相比无差异(P0.05)。结论:嗜酸乳杆菌可有效缓解β-Lg过敏,其预防效果可能与优化肠道微生态环境密切相关。     

淡水鲈鱼小清蛋白致敏性及其对小鼠肠道菌群的影响

目的研究淡水鲈鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)的致敏性,同时探索其对小鼠肠道菌群的影响。方法 36只C3H/HeJ小鼠按体重随机分为3组,分别为空白对照组(CK组)、卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)致敏对照组(OVA组)和小清蛋白致敏组(PV组)。使用生理盐水、OVA溶液和PV溶液通过经口灌胃在6周时间内进行致敏,实验最后一天进行大剂量刺激,测定小鼠的体温变化、血清抗体水平和相关细胞因子水平,取腹腔灌洗液测定其中蛋白的含量以评价小鼠血管渗透性的变化,利用流式细胞术测定各组小鼠脾脏(SP)和肠系膜淋巴结(MLN)中T细胞亚群的水平。取小鼠粪便,对肠道菌群进行16S rRNA高通量测序,探索小清蛋白对小鼠肠道菌群的影响。结果与空白对照组相比,OVA小鼠血清抗体、细胞因子和免疫组织Th2相比水平均显著升高(P0.05),且表现出明显过敏症状。PV处理也使小鼠表现出明显的食物过敏症状,但仅显著升高了小鼠血清免疫球蛋白G1(Immunoglobulin G1, IgG1)和白细胞介素10(Interleukin 10, IL-10)的水平(P0.05)。16S rRNA高通量测序结果显示, OVA处理升高了小鼠肠道中属于拟杆菌门和变形菌门群落的水平,而PV处理升高了属于厚壁菌门菌群的丰度。结论淡水鲈鱼小清蛋白对小鼠具有一定的致敏性,但其致敏机理及对肠道菌群的影响作用与OVA不同。     

适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉的致敏性评价

牛奶是婴儿饮食中最早引入的食物之一,也是引起食物过敏最常见的原因之一。因此,低致敏奶粉的研制具有重要意义。该文采用4周龄雌性BALB/c小鼠,以灌胃方式致敏。将乳清蛋白浓缩物作为阳性对照,通过观察过敏症状,计算脾脏系数,测定血清中总免疫球蛋白E(IgE)和组胺含量,对适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉进行致敏性评价。结果表明:乳清蛋白浓缩物组出现了明显过敏症状,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数显著高于空白及佐剂对照组,说明乳蛋白致敏模型成功建立;适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组无过敏症状,与空白组及致敏佐剂组相比,血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均无显著差异,说明适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉未引起小鼠过敏;同样,由于深度水解破坏了乳清蛋白抗原表位,深度水解乳清蛋白粉也未引起小鼠致敏;而普通脱脂奶粉致敏小鼠血清中总免疫球蛋白E(IgE)、组胺含量以及脾脏系数均显著高于空白组及致敏佐剂组,说明普通脱脂奶粉导致小鼠致敏。因此,适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉可有效降低或缓解牛奶过敏症状,但仍有待于更多临床试验的验证。     

益生菌改善牛乳蛋白过敏性的研究进展

牛奶蛋白过敏是儿童早期最常见的食物过敏反应之一,通常会持续到成年期。益生菌影响肠道微生物群并调节免疫反应。因此,它可能是可以缓解某些涉及肠道免疫系统疾病的工具,例如尚无治疗方法的牛乳蛋白过敏。本文中探讨了牛奶蛋白过敏的重要研究进展,介绍了牛乳蛋白过敏原和过敏机理。重点强调了益生菌在牛奶蛋白过敏方面取得的最新进展,通过调节肠道菌群和提高肠道免疫来改善牛乳蛋白过敏。最后阐述了低致敏性产品的研究现状,提出了研究及应用中面临的主要问题。益生菌改善牛乳蛋白过敏性的深入研究是过敏领域的重大突破,为缓解牛乳过敏提供理论依据。     

双歧杆菌对Treg/Th17细胞平衡及中国对虾蛋白致敏性的影响

目的通过体内实验研究婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis 13.085)和雷帕霉素对中国对虾原肌球蛋白致敏BALB/c小鼠过敏反应的治疗作用,从Treg/Th17细胞平衡及相关细胞因子角度探讨其缓解过敏的免疫调节作用机制。方法将中国对虾原肌球蛋白和弗氏佐剂混合液腹腔注射诱发BALB/c小鼠致敏,建立动物过敏模型。将实验小鼠随机分为正常对照组、致敏对照组、双歧杆菌治疗组、雷帕霉素治疗组。观察分析小鼠过敏症状,采用ELISA测定小鼠血清中特异性IgE、IgG2a的含量,采用流式细胞术测定脾脏T淋巴细胞亚群(Treg、Th17)数量,采用荧光定量PCR测定脾脏中Treg型和Th17型细胞因子和转录因子的表达量。结果第56天实验周期结束后结果发现,相比于致敏对照组,双歧杆菌和雷帕霉素治疗组小鼠过敏症状有明显的缓解,血清中特异性IgE显著降低(P0.05),脾脏Treg/Th17比值显著升高(P0.05),Th17型细胞因子IL-17A m RNA表达水平显著降低,Treg型细胞因子Foxp3 m RNA表达水平显著升高。此外,不同剂量的雷帕霉素治疗组缓解过敏反应存在剂量差异性。结论双歧杆菌13.085和雷帕霉素能有效缓解小鼠过敏症状,其作用可能通过平衡Treg/Th17细胞亚群数量,促进Treg型细胞因子表达而抑制Th17型细胞因子分泌有关。     

Effect of the structure and potential allergenicity of glycated tropomyosin,the shrimp allergen

The aim is to elucidate whether the structural changes of shrimp tropomyosin (TM) following ribose treatment affected its potential allergenicity. The structural changes of glycated TM were analysed by fluorescence, ultraviolet spectrum (UV), circular dichroism (CD) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), and the changes in allergenicity were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and RBL-2H3 cell model. The result indicated that ribose could cause the conformational structural changes of TM. Moreover, the phenylalanine, isoleucine and DL-methionine residues were altered by ribose by LC-MS/MS analysis. These modified amino acids also appeared in the shrimp allergic epitopes region. Furthermore, the glycated TM (4000 mmol L⁻¹ ribose) could significantly decrease the IgE-binding capacity and inhibit the release of cytokines and mediators from RBL-2H3 cells. These findings suggest that ribose-induced glycation could damage the allergic epitope of TM, decreasing the potential allergenicity and could be considered for alleviating TM-induced food allergy.     

Oral tolerance induction does not resolve gastrointestinal inflammation in a mouse model of food allergy

Scope : Oral immunotherapy (OIT) involving continuous oral administration of allergenic foods has gained attention as a therapy for food allergies. To study the influence of oral administration of allergenic foods on gastrointestinal symptoms including inflammation, we established a mouse model of food‐induced intestinal allergy. Methods and results : BALB/c mice were fed an egg white (EW) diet containing ovalbumin (OVA, a major EW allergen) after intraperitoneal sensitisation with OVA and Alum. The mice on the EW diet for one wk presented gastrointestinal symptoms (i.e. weight loss and soft stools) and inflammation in the small intestines (i.e. duodenum, jejunum and ileum). Further continuous EW diet resolved the weight loss but not the soft stools. Splenic CD4⁺ T‐cells of EW diet‐fed mice on the continuous diet showed less proliferation and cytokine production compared with those of control mice, suggesting tolerance induction by the diet. The continuous EW diet reduced levels of OVA‐specific IgE antibodies, but significantly aggravated the inflammation in the jejunum. Conclusion : Our mouse model would be useful to investigate inflammatory and regulatory mechanisms in food‐induced intestinal allergies. Our results suggest potential gastrointestinal inflammation in patients undergoing OIT as continuous administration of allergenic foods, even though the therapy may induce clinical tolerance.     

肠道菌群调控下的食物过敏机制研究进展

随着过敏人群数量的快速增加,食物过敏日益受到人们的关注。肠道微生物在机体免疫系统的形成和发展 中扮演着重要角色,越来越多的研究表明,抗生素的使用、膳食结构的改变等因素所引起的肠道菌群紊乱将会增加 人群患食物过敏的机率。本文将从细胞和分子水平综述目前对口服耐受的产生及因其缺失而引起食物过敏的相关机 理的研究,并在此基础上讨论肠道微生物调节食物过敏的潜在通路,最后概述有关益生菌缓解食物过敏的应用及机 制研究。通过了解肠道微生物与宿主黏膜系统的相互作用,可为预防及治疗食物过敏提供新的调控靶点和研究思 路,并为益生菌缓解食物过敏提供理论依据和改进方案,从而减少食物过敏的发生。     

益生菌复合配方对小鼠肠道功能的影响

目的:推动益生菌复合配方工业化生产。方法:建立小鼠便秘、肠黏膜损伤、腹泻模型,考察对照组、模型组和干预组小鼠的小肠墨汁推进率、排便情况、肠黏膜组织切片,并结合肠黏膜损伤评分和腹泻评分进行综合评价。结果:与模型组相比,中、高浓度益生菌复合配方能显著提高便秘模型小鼠的黑便粒数、重量和小肠墨汁推进率,同时显著降低肠黏膜损伤模型小鼠的肠黏膜损伤评分,减轻组织病理损伤。对于腹泻模型小鼠而言,低、中、高浓度益生菌复合配方干预均可显著降低小鼠肠黏膜损伤等级。结论:中、高浓度的益生菌复合配方均具有改善小鼠便秘,减轻肠黏膜损伤,缓解腹泻症状的作用,其中高浓度效果更佳。     

高通量测序分析益生菌对冷食小鼠肠道菌群的干预

采用高通量测序技术分析益生菌对冷食小鼠肠道菌群的影响。将实验小鼠随机分为模型组、对照组和低中高剂量组,分别灌喂等量的普通冰淇淋、107 cfu/m L益生菌液和107、108、109 cfu/m L的益生菌冰淇淋。连续灌喂15d,记录并计算小鼠的稀便率和腹泻指数,15 d后,收集各组小鼠粪便进行高通量测序分析。发现食用冷食会导致部分小鼠腹泻,在剂量范围内,益生菌可以缓解冷凉性敏感小鼠的腹泻症状,高剂量组小鼠的稀便率降低了3.11%,腹泻指数(10-1)降低了0.33,抑制效果较其它各组最为明显。服用了益生菌的小鼠粪便菌群多样性较高(高剂量组ACE值为69987.29,Chao1值为27098.77),乳酸菌属、艾克曼氏菌属、Blautia等菌属占比增大,菌群结构发生改变。因此益生菌可以提高冷凉性腹泻敏感小鼠对冷食的接受度,冷冻载体下的益生菌可以在小鼠肠道中定植并对小鼠肠道起到调节作用。     

基于动物模型的大豆球蛋白诱导肠黏膜过敏反应机理研究

目的:探究大豆球蛋白诱导小鼠肠黏膜过敏反应的调控机理。方法:以大豆球蛋白和β-伴球蛋白为试验材料,Balb/c小鼠为受试动物,采用连续灌胃的方式建立肠道过敏动物模型。研究了小鼠小肠绒毛T、B淋巴细胞的数量、肠细胞凋亡率和固有层IgA+浆细胞的数量及小肠液中sIgA的含量。结果:与对照组相比,大豆球蛋白组小肠绒毛固有层淋巴细胞CD3^+、CD4^+数量显著高于对照组(P<0.01);大豆β-伴球蛋白组小肠绒毛固有层及肠上皮细胞中CD3^+、CD8^+、CD4^+及整合素α4β7的数量均显著高于对照。高倍镜下观察显示试验组小鼠小肠固有层中可见大量浆细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润;试验组小鼠小肠固有层IgA+浆细胞呈现明显的阳性染色。结论:大豆球蛋白可以介导细胞免疫为主的过敏反应发生,肠黏膜上皮细胞凋亡亢进是造成肠道通透性加强,进而破坏肠黏膜屏障功能的重要原因。