抗TMV普通烟中N导入片段的特异分子标记开发与交换单株筛选

  背景和目的  N导入片段赋予烟草品种对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）抗性,但同时带来产量低等连锁累赘,为了筛选减少连锁累赘的交换单株。  方法  以普通烟草中的N导入片段为材料,利用茄科作物基因组序列数据和比较基因组学方法,开发了特异扩增N导入片段的系列分子标记,通过分子标记在种质资源和分离群体中筛选交换单株。  结果  开发出23个N导入片段特异的分子标记,将携带N导入片段的普通烟种质划分为Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三种长度类型。供试90份抗TMV的普通烟资源中,85份属于N导入片段长度相对较短的Coker176类型,未发现比Coker176更短的种质资源。利用N导入片段末端分子标记TN5.51,从不含N基因的K326、Y87、5F、HD与Coker176配置的4个回交分离群体的22572株抗TMV单株中,筛选到11株N导入片段交换单株,Coker176类型的N导入片段在普通烟中的交换频率为0.049%。其中24-8H等3个单株的N导入片段缩短约一半,具有减少连锁累赘的潜力。  结论  本研究获得了普通烟中N导入片段的系列分子标记和长度缩短一半的交换单株,为解析N导入片段连锁累赘的分子机理、减少连锁累赘奠定了基础。      

一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记

烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus,TMV）是烟叶生产的主要病害,为建立烟草抗TMV分子标记辅助选择体系,本研究以高抗TMV烤烟品种Coker176和易感TMV烤烟品种Y3以及它们的BC1F1群体为试材,采用分离集团分组分析法（Bulked Segregation Analysis,BSA）和简单序列重复（Simple Sequence Repeat,SSR）标记技术,筛选与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记。通过对18764对SSR引物的分析表明,有396对SSR引物在两亲本间有多态,选出1对SSR引物TM508-007扩增出的标记与TMV抗性的N基因紧密连锁,遗传连锁距离为0.41 cM,证实获得的与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记稳定可靠,可用于烟草抗TMV分子标记辅助选择。      

不同烟草群体间遗传多样性分析

利用SRAP标记对81份烟草种质进行遗传多样性分析,根据种性来源将81份种质材料分为黄花烟地方种质、普通烟草地方种质、选育种质以及引进种质四个群体.结果表明:(1)从160对引物组合中筛选出17对扩增带清晰、重复性和多态性好的引物用于81份烟草种质资源遗传多样性研究,共检测到163个位点,其中123个位点具有多态性,多态性比例为75.5%,平均每个引物检测到10个位点.遗传多样性指数(Nei's)和Shannon's指数分别为0.41和0.57,种质间遗传相似系数变异范围在0.11～0.99之间,说明我国烟草种质资源中存在着丰富的遗传变异. (2)四个群体遗传差异由大到小分别为:黄花烟地方种质>普通烟地方种质>引进种质>选育种质.(3)聚类分析可将81份种质材料划分为黄花烟草和普通烟草2大类群,烤烟、晒晾烟、白肋烟、雪茄烟以及香料烟五种栽培类型之间没有明确的界线;聚类分析和主坐标分析计算结果表明,黄花烟地方种质与其它三个群体的遗传距离较远,表明目前在我国烟草育种中对黄花烟的利用较少.引进种质和选育种质群体间遗传相似系数为0.99,说明目前我国烟草育种中较多利用引进种质,对具有丰富遗传变异的地方品种利用较少,育种亲本遗传基础狭隘.     

烟草根黑腐病抗性位点RBRR1的InDel分子标记开发与分析

  背景和目的  RBRR1是通过远缘杂交与回交导入栽培烟草的一个单显性广谱型根黑腐病抗病位点,为了开发基于该位点的简单高效稳定且成本低的紧密连锁分子标记。  方法  在已有酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）标记相关序列基础上,利用云晒1号基因组与抗、感根黑腐病材料重测序信息,基于其序列插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）多态性设计抗病相关分子标记,并开展遗传效应和遗传变异分析。  结果  筛选到4对具有良好多态性的引物,在目标单株的分子标记辅助选择中具备便捷、高效且呈共显性的特点。遗传效应分析表明,通过分子标记辅助选择导入RBRR1位点能够极显著提高栽培烟草根黑腐病抗性。遗传变异分析结果显示,在烟草核心种质资源中仅有白肋烟TN90和SoTa2携带有RBRR1抗病基因,并发现4对引物在普通烟草自然群体中呈现2种基因型。  结论  RBRR1抗病位点在我国尚未进行广泛利用,具有较高的利用价值;而开发的4个InDel标记可用于该抗性位点的分子标记辅助选择育种和后续抗病基因的精细定位与克隆。      

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

利用荧光MFLP 标记技术分析烟草种质的遗传多样性

微卫星锚定片段长度多态性(MFLP)是一种新型分子标记技术,本研究依据该技术原理,通过将M13 通用荧光接头连接在设计的 SSR 引物上对扩增产物进行荧光标记,建立了适合于烟草的荧光 MFLP 标记体系;在此基础上,利用该技术从144对选择性扩增引物组合中筛选出15对适宜的引物组合,对32份来自于不同国家和地区的烟草种质材料的遗传多态性进行了分析。试验结果显示,这些引物组合扩增的产物在 32 个烟草种质中的多态性范围为 2～13 个,平均 4.3 个;利用种质材料间遗传多态性开展的遗传相似性分析表明,32 份烟草种质间的相似系数在0.40到0.83之间。运用UPGMA聚类分析和主坐标分析法,有效地将这些烟草种质材料的来源和类型进行了分类。结果表明,荧光 MFLP 标记技术能有效地发现供试烟草材料的DNA多态性,表明该技术适用于烟草遗传特性分析的研究和应用。     

绒毛状烟草和林烟草全长cDNA文库构建及EST序列分析

表达序列标签（EST）广泛应用于基因功能研究和分子标记开发。以普通烟草两个二倍体祖先种绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis,TT）和林烟草（Nicotiana sylvestris,SS）多个组织为试验材料,使用CloneMiner cDNA文库构建方法构建了均一化全长cDNA文库,测序并进行序列拼接、功能注释、进化分析和标记开发。绒毛状烟草和林烟草均一化全长cDNA文库容量分别为0.72×10⁶和1.12×10⁶ pfu/mL,重组率分别约为94%和93%,插入片段平均长度为1.4 kb。测序获得20 953条EST序列,拼接为10 504个unigenes。与普通烟草EST序列混合拼接,产生34 450条contigs,123 511条singletons,烟草异源四倍体中T和S基因与绒毛状烟草、林烟草之间的相似性远高于两个二倍体祖先种之间。预测获得104 915个编码序列,其中73 670个序列包含功能结构域,81% unigenes在番茄中具有同源基因。鉴定了11 869个微卫星位点（SSR）和25 209个单核苷酸多态性位点（SNP）。这些数据信息对于烟草基因功能研究和分子育种具有重要价值。     

利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

利用双单倍体技术可加快杂交后代目标性状的纯合。为了选育双抗烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的烟草材料,本文采用Coker176与NC55的F1与非洲烟杂交获得单倍体苗,经过苗期抗性鉴定、分子标记辅助选择和叶脉培养加倍,获得母本来源的双抗TMV和PVY的双单倍体。通过人工接种抗性鉴定、标记检测和田间株系比较,获得抗性、植物学性状稳定的双单倍体第三代种子。与常规杂交系统选育相比较,双单倍体方法的获得后代变异更大、性状更容易稳定。      

侵染海南雪茄烟的中国黄花稔曲叶病毒侵染性克隆的构建

  背景和目的   中国黄花稔曲叶病毒（Sida yellow mosaic China virus,SiYMCNV）是侵染海南儋州雪茄烟的重要病原,为了分析该病毒的致病性,以侵染海南雪茄烟的SiYMCNV分离物为材料,构建SiYMCNV的侵染性克隆。  方法   以侵染SiYMCNV的雪茄烟植物总基因组为模板,分别构建含有1.5倍串联重复DNA-A全长侵染性克隆pCAMBIA1300-1.5A和含有2倍串联重复DNA-β全长侵染性克隆pCAMBIA1300-2β。采用液氮冻融法转化农杆菌GV3101,通过农杆菌浸润验证侵染性克隆的致病性。  结果   SiYMCNV DNA-A单独侵染本氏烟和雪茄烟H382不表现症状,DNA-A和DNA-β混合侵染本氏烟和雪茄烟H382表现出典型的曲叶症状,且整株植物表现为矮化、皱缩。  结论   构建的中国黄花稔曲叶病毒侵染性克隆可高效侵染本氏烟和雪茄烟H382,为进一步开展该病毒致病性机制研究和抗病烟草种质资源鉴定奠定了坚实基础。