实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的：为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。方法：根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果：该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11 份样品进行检测,其中6 份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104 CFU/mL之间。结论：建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法

根据已报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法,对其特异性和灵敏度进行了评价,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。结果显示,该方法对2株植物乳杆菌能得到阳性扩增,其余11株乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,灵敏度高达0.001 ng/μL,而且在退火温度为50~60℃范围内不影响其特异性,表明该方法对退火温度不敏感;用微生物菌制剂和酸奶共13种益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。因此,该研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够快速、准确、高效地检测微生物菌制剂及其他益生菌产品中的植物乳杆菌。     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明:该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到10~4 CFU/m L。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25份市售实际样品进行测试,有5份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

空肠弯曲菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

以C.jejuni ORF-C基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测C.jejuni的方法。结果显示,对15株试验菌株进行荧光定量PCR检测,只有C.jejuni菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为11 CFU/m L,利用该检测方法对采集的60份样品进行检测,共计检出1份C.jejuni阳性样品,与国标法GB 4789.9—2014检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

定量PCR技术检测杀菌型产品中乳酸菌

目的利用定量PCR(quantitativePCR,qPCR)技术检测杀菌型产品中乳酸菌,并与标签标示相比较,查探产品中各类菌种的异同性及数量。方法以市售的发酵乳及含乳饮料作为研究对象,设计可区分产品中常见的6种乳酸菌特异性引物及探针,利用qPCR技术对方法的特异性、灵敏度进行验证,并建立标准扩增曲线;利用模拟样品对方法进行检验,最后对市场上购买的实际样品进行检测。结果除去干酪乳杆菌,其他5种引物都能特异性扩增出其目标菌,并且对其他的乳酸菌均无扩增现象;DNA检测的灵敏度可达到2～4pg;单一标准菌种扩增曲线线性较好,相关系数r2值在0.954～0.992之间;对模拟样品的检测,与平板法差异性比较,P值均大于0.05,无显著性差异。对市售样品进行检测,产品中标记的干酪乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌与检测结果存在不匹配现象。结论本研究建立的qPCR方法可快速、准确地对产品中德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌的鉴定和定量的分析。     

一种检测发酵乳中嗜酸乳杆菌的定量定性方法

根据乳酸菌的16S rDNA基因序列设计嗜酸乳杆菌种特异性引物,应用种特异性PCR和实时荧光定量PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析,建立快速、准确地检测发酵乳中L.acidophilus的定量和定性方法。     

一种检测β溶血性链球菌的荧光环介导等温扩增方法的建立

目的 研究β溶血性链球菌的荧光环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测方法,实现对β溶血性链球菌的快速检测。方法 针对β溶血性链球菌spy1258基因设计4对特异性引物,对建立的LAMP体系优化其反应扩增条件,并对该方法特异性和灵敏度评价,并将该方法和国标法分别应用于10份牛奶样品的检测。结果 该方法特异性强,内外引物比为3:1,反应温度为63℃时达到最佳反应条件,检测灵敏度达100 fg/μL,检出限低至9.8 CFU/mL ,且10种样品的LAMP法与传统国标法检测结果一致。结论 本研究建立的荧光LAMP法具有快速,直观,灵敏度高和特异性强等优点,可应用于食品β溶血性链球菌的初步筛选。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

应用RT-PCR技术定量检测发酵乳中Lactobacillus plantarum活菌数

根据发酵乳中常见乳酸菌种的16S rRNA基因序列设计了L.plantarum的种属特异性引物,应用该引物对植物乳杆菌的模式菌株L.plantarum ATCC14917、L.plantarum非同源性对照菌株及采自西藏地区的自然发酵乳样品进行了种属特异性PCR检测,并以样品RNA转录的cDNA为模板,对检出含有L.plantarum的发酵乳样品进行了Real-Time PCR定量检测。通过Real-Time PCR图谱分析,准确地检测出了该样品中L.plantarum活菌数的含量为6.6lgcfu/mL。结果表明该方法能够简便、快速地检测出发酵乳中是否含有L.plantarum,并能够对其活菌数进行准确地定量,对发酵乳的生产和监管提供了重要的理论和实践依据。     

基于荧光定量PCR鉴定冷鲜肉制品中羊源性成分及其含量

建立一种快速、准确鉴定羊肉制品中羊源性成分并且量化羊肉成分含量的方法。以羊线粒体细胞色素b基因为靶基因,设计出具有特异性引物。选择真核生物核糖体16S rDNA为内参基因,采用实时荧光相对定量法。羊肉质量百分比的对数值与之对应的循环阈值差值ΔCt呈良好线性关系。标准曲线回归公式为y=-3.4057x-0.3112,R2=0.9916,扩增效率达E达96.62%。本试验中羊源性DNA检测限可达16 pg/μL,回收率在93.07%~106.20%。抽取8份市售羊肉制品进行检测,有3份含量低于50%。本试验中建立的实时荧光PCR检测方法操作方便、特异性强、灵敏度高,所得数据可靠,为肉制品羊源性成分检测提供了参考方法。     

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。     

Direct observation of bacterial exopolysaccharides in dairy products using confocal scanning laser microscopy

The objective of this work was to develop a methodology for direct visualization of bacterial exopolysaccharides (EPS) in fully hydrated dairy products. The new method involved staining EPS with wheat germ agglutinin labeled with Alexa fluor 488 or staining with concanavalin A 488. Samples were observed using confocal scanning laser microscopy. Distribution of EPS produced by Lactococcus lactis (CHCC 3367), a combination of Streptococcus thermophilus (CHCC 3534) and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (CHCC 769) and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR in milk was compared in stirred and unstirred fermented milk. The EPS and proteins were observed as distinct entities, with EPS present in the protein network pores. EPS was observed in greater amounts in milk fermented by the ropy L. lactis culture than in milk fermented by the less ropy strain of S. thermophilus. Stirring the fermented milk caused aggregation of EPS into more extended structures. The more ropy the culture, the longer and larger the strands formed during stirring. The method was also applied to Feta cheese made with an EPS-producing strain of S. thermophilus. EPS was observed in the cheese as thick sheets filling pores in the protein network.     

一种快速定性和定量检测发酵乳中L.fermentum的方法

通过比对发酵乳杆菌(L.fermentum)与其他乳酸菌的16S rRNA基因序列的异同,设计出L.fermentum的种属特异性引物,应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析,建立一种快速检测发酵乳中L.fermentum定性和定量测定方法.