现代分子生物学在NDV研究和生产中的应用

本文论述了现代分子生物学技术在ＮＤＶ的检测和基因工程疫苗方面的应用。评估了ＲＮＡ指纹图谱、核酸探针及ＰＣＲ等方法的优缺点及应用前景，重点概述了可以用于ＮＤＶ强弱毒株鉴别检测的核酸探针法和Ｆ蛋白裂解位点多肽抗血清法。介绍了ＮＤＶ在各种载体包括禽痘病毒、痘苗病毒、火鸡疱疹病毒和昆虫杆状病毒系统中的表达及其表达产物作为疫苗的可能性     

以氯化三苯四氮唑校正纸片扩散法检测天然抗菌成分的误差

目的:对现行纸片扩散法(K-B法)检测天然抗菌成分存在显著误差的原因进行分析,提出改进方法.方法:采用氯化三苯四氮唑(TTC)对指示菌显色、分析天然产物乙醇浸膏中抗菌成分的极性、样品在平板培养前适当扩散等方法,对K-B法检测天然抗菌成分存在显著误差的原因进行了研究.结果:天然产物中存在中极性、弱极性甚至非极性抗菌成分,在培养基中扩散较慢,现行K-B法以透明抑菌圈为判读抗菌活性依据,会低估样品抗菌活性,甚至出现假阴性结果,造成漏筛.以不能被TTC显色的指示菌范围和透明抑菌圈之和来判读天然产物抗菌活性,提高了K-B法检测天然抗菌成分的准确性和可靠性.结论:现行K-B法不能直接应用于由有机溶剂提取的天然抗菌成分的活性检测,TTC显色K-B法可有效消除由样品扩散速度较慢引起的显著误差.     

混合溶液中茶多酚、植酸含量的分光光度法测定及干扰消除

茶多酚和植酸均可用作食品保鲜剂,复配使用效果更好。采用分光光度法同时测定混合溶液中茶多酚和植酸的含量,并消除相互之间的干扰。研究结果表明,植酸对茶多酚的显色无影响,可采用酒石酸亚铁显色法直接测得混合溶液中茶多酚的含量;而当采用三氯化铁-磺基水杨酸显色时,茶多酚和植酸均有显色,且混合溶液中茶多酚质量浓度影响植酸的显色能力。采用数学模拟法可消除茶多酚对植酸显色能力的干扰,获得植酸的标准曲线。此方法检测最佳范围为茶多酚质量浓度0～0.300 mg/mL,植酸质量浓度0～3.000 mg/mL,回收率96%～103%。方法操作简单,准确度高,可为混合组分的同时测定提供理论依据。     

小麦粉中溴酸钾含量快速测定方法研究

根据溴酸钾(KBrO3)可在酸性条件下氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)而显色的原理,建立了小麦粉中溴酸钾定性检测的目视比色法和定量检测的分光光度法。研究了体系酸度、显色液用量、反应时间对显色的影响,并确立了最优化的实验条件。结果表明:在最优化实验条件下,显色体系的颜色随溴酸钾含量的升高而逐渐加深,溴酸钾浓度在0~4 mg/L范围内符合比尔定律,线性回归方程为ΔA=0.2437C-0.005 2,R2=0.999 3。可用于实际样品的测定,目视比色法可快速确定溴酸钾的含量范围,分光光度法的回收率为96.51%~101.70%,RSD为1.79%~3.12%,能够满足市场监管的需求。     

猪脾脏多肽的酶法制备及其生物活性研究

目的 探索酶解法制备猪脾脏多肽的最佳条件,检测所得产物的生物活性.方法 用胰酶酶解法、正交试验、甲醛滴定法考察最佳酶解条件,用乙醇沉淀法收集多肽,并分别用Fe2+诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化体系和纤维蛋白平板法检测多肽的抗氧化活性和溶栓活性,CM-Sepharose离子交换层析纯化最佳酶解条件F的脾多肽,利用SDS-PAGE电泳确定具备促凝活性的多肽分子片段相对分子质量.结果 最佳酶解条件为60℃,pH 7.0,加酶量6.0%,时间5.5 h;检测到脾多肽具备抗氧化活性和促凝活性,经纯化后的脾多肽促凝时间比正常对照提前20 s.结论 可初步判断猪脾脏多肽在抗氧化和凝血方面有一定作用,且首次证实猪脾多肽具有凝血功能.     

猪脾脏多肽的酶法制备及其生物活性研究

目的 探索酶解法制备猪脾脏多肽的最佳条件,检测所得产物的生物活性.方法 用胰酶酶解法、正交试验、甲醛滴定法考察最佳酶解条件,用乙醇沉淀法收集多肽,并分别用Fe2+诱发卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化体系和纤维蛋白平板法检测多肽的抗氧化活性和溶栓活性,CM-Sepharose离子交换层析纯化最佳酶解条件F的脾多肽,利用SDS-PAGE电泳确定具备促凝活性的多肽分子片段相对分子质量.结果 最佳酶解条件为60℃,pH 7.0,加酶量6.0%,时间5.5 h;检测到脾多肽具备抗氧化活性和促凝活性,经纯化后的脾多肽促凝时间比正常对照提前20 s.结论 可初步判断猪脾脏多肽在抗氧化和凝血方面有一定作用,且首次证实猪脾多肽具有凝血功能.     

乙酰胆碱酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测中的应用

为满足食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速检测，研究采用酶抑制显色方法，应用自制的乙酰胆碱酯酶制成农药快速检测试剂盒检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，检测灵敏度在0．001mg／kg-0．1mg／kg范围。试剂盒为现场检测这两类农药提供了简便而快捷的方法。     

发酵时间对浆水中亚硝酸盐含量的影响

基于食品中亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸,盐酸萘乙二胺的反应,其生成产物的最大吸收波长为538nm,建立了盐酸萘乙二胺比色法测定浆水中微量亚硝酸盐的的新方法,该法简便,快速,选择性好。线性相关系数为0．9999。本法用于浆水中亚硝酸盐的测定。样品液先经过过滤,能有效去除浊度对亚硝酸盐的显色造成的干扰;显色剂先加入2mL对氨基苯磺酸溶液,5rain后再加入lmL N-1-萘乙二胺盐酸溶液,使显色稳定。     

筛选降尿酸肽的体外测定方法的建立与优化

由于紫外分光光度法、NBT/PMS显色法、荧光分析法,MTS/PMS还原法等黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性检测方法对多肽检测的局限性,本文建立了适用于筛选降尿酸多肽类物质的体外测定方法,采用双酶偶联法联合高效液相色谱法(HPLC法)测定多肽类物质的体外黄嘌呤氧化酶抑制活性。以双酶偶联法优化样品测定的反应体系,得到最适反应条件:黄嘌呤浓度0.22 mmol/L,酶浓度0.52 u/m L,缓冲液pH 8.0,反应温度30℃,反应时间20 min;优化尿酸分离的液相条件,确定最适检测条件:95%15 mmol/L NH4H2PO4+5%甲醇,pH 6.5,流速1 m L/min,柱温25℃,检测波长290 nm。实验表明,最适条件下双酶偶联法和HPLC法检测精密度良好,准确度达95%以上。双酶偶联法联合HPLC法可高效、准确进行多肽降尿酸活性检测。双酶偶联法联合HPLC法证明还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,可作为降尿酸肽。     

溴甲酚绿吸光光度法测定食盐中碘含量的研究

研究了在盐酸介质中,碘酸钾、碘化钾与溴甲酚绿的显色反应。结果表明,反应产物的最大吸收波长在364nm。在实验条件下,碘量在0～1.0×10-4mol/L内服从郎伯-比尔定律,线性相关系数R2为0.9991,摩尔吸光系数为:5.01×104L/mol.cm。该法用于加碘食盐中微量碘酸钾的测定,其RSD为1.95%～2.10%(n=6),由此建立了一个简单、方便、快速测定食盐中微量碘酸钾的新方法。     

微波加热双酶协同水解玉米蛋白粉制备玉米肽

以玉米蛋白粉为原料,采用微波加热多酶协同水解法制备小分子肽。确定了最佳水解工艺。水解后的多肽经过Sephadex G-15分离得到两个组分,分别测定两个组分对超氧自由基的抑制能力,结果为分子量大于1355u的组分对超氧自由基的清除能力大于分子量小于204u的组分。     

Detection of Low Molecular Weight IReduced Zein Polypeptides Separated by Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Several bands including some low molecular weight (MW) peptides [9 and 11 kd (Kilo-Dalton)] were visualized in reduced zeins after separation by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electro-phoresis (SDS-PAGE). It was concluded that 40% isopropanol-10% acetic acid was effective in fixing these fast moving polypeptides. The demonstration of higher MW (40-45 Kd) polypeptides may have also resulted from this treatment.     

FRACTIONATION OF HIGH MOLECULAR WEIGHT POLYPEPTIDES FROM BEER USING TWO DIMENSIONAL GEL ELECTROPHORESIS

High molecular weight polypeptides from beer were fractionated by a two dimensional gel electrophoretic method comprising isoelectric focusing in the first dimension followed by gradient gel electrophoresis in the second dimension. Silver stained gels revealed a complex pattern of spots which is consistent with individual polypeptide species having both discrete isoelectric points and molecular weights. The pattern of silver stained spots was reproducible both within and between beers and was independent of the sample preparation method or the composition of the sample solubilisation mix. Beers produced from grists containing malt plus 20% wheat flour were shown to contain four polypeptides of approximate molecular weight 30 000, 30 000, 16 000 and 15 000 which were absent from all malt control beers.     

The Gel Filtration Chromatographic‐Profiles of Proteins and Peptides of Wort and Beer: Effects of Processing — Malting,Mashing, Kettle Boiling,Fermentation and Filtering

Barley and malt proteins, of infusion (IoB) and decoction (EBC) mashing worts as well as commercial wort and beer, obtained from the Castlemaine Perkins brewery, Brisbane, were gel filtered, with or without further treatments. A general, similar pattern of protein and peptide profiles emerged from barley malt and beer. This confirmed the widely assumed fact that beer proteins descend from barley, some transformed and others perhaps mostly unchanged by processing. In the gel‐filtrate profiles, a maximum of 8 or 9 fractions were discerned. These fractions were collected and quantified for protein contents and amino acid compositions. The first four fractions contained the proteins and polypeptides of molecular weight higher than 14,000. Consequently, the remaining fractions contain the smaller peptides (<14,000), that were completely removed by dialysis. The effects of processing on proteins and peptides varied contingent upon the type of processing step considered and the pre‐chromatographic treatment. Malting was the most effective process remarkably increasing the soluble protein contents, especially the smaller peptide fractions and the colour development. This is the first report, as far as we are aware of, on the gel filtration profiles of wort and beer low molecular weight peptides including those of barley wort. The importance of the smaller peptides in foam formation and retention cannot be overemphasised. The amino acid composition of the fractions revealed much more diversity than was observed in the comparison of the profiles. Proline content of fraction 1 resembled that of barley soluble proteins while fractions F2, F3 and F4 that of glutelin and only fraction 8 that of hordein. The latter, suggests that hordeins or, at least the peptide products rich in proline, are likely to be completely digested to amino acids, during malting.     

金华火腿中小肽的分离纯化及结构研究

采用切流向过滤、葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤层析对成熟前和后熟结束时期金华火腿中小肽进行分离纯化。结合高效液相色谱-串联质谱仪进行分析,得到26种主要的小肽。其中有7种肽重现性较好,相对峰面积较高,其氨基酸序列分别为Ala-His、Pro-Leu、Ser-Gly-Val、Ser-Gly-Phe、Pro-Leu-Lys-Pro-Ala、Leu-Leu-Ala-His 和Asn-Pro-Thr,对应的相对峰面积分别为17.81%、8.62%、10.58%、5.70%、6.11%、6.12%和3.49%。     

河套小麦胚芽源多肽的抗氧化活性研究

利用中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解河套小麦胚芽蛋白获得多肽,测定其体外抗氧化能力,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其多肽分布。结果表明,胚芽蛋白及多肽浓度与抗氧化能力呈正相关。不同浓度的中性蛋白酶酶解获得的多肽的抗氧化能力显著高于胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解获得的多肽（P<0.05）,其还原能力、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS+）和1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）清除率最高达（1.17±0.004）1.0 mg/mL、（84.82%±0.87%）1.5 mg/mL和（55.01%±0.01%）1.0 mg/mL,且其ABTS+和DPPH自由基清除率均显著高于胚芽蛋白（P<0.05）。另外,不同蛋白酶水解能力不同,其中胃蛋白酶的水解能力最大,中性蛋白酶水解能力最小;胚芽蛋白多肽的抗氧化能力与其分子量大小相关,但不一定蛋白多肽的分子量越小,其抗氧化效果越好。上述结果为进一步研究河套小麦胚芽抗氧化肽提供了一定的参考依据。     

胶原蛋白酸解为胶原多肽的动力学研究

通过全波长扫描和凝胶渗透色谱,对水解过程动态及其多肽分子质量的变化进行了研究,考察了水解温度、酸用量等因素对水解动态的影响,并对酸法水解的过程动力学进行了分析。结果说明:鸭掌胶原蛋白酸法水解得到的多肽分子质量分布不均匀,分子质量大小随反应时间的增大而减小;增大酸用量和提高温度可使水解反应更彻底,水解过程可用一级反应动力学方程进行描述。     

美国红鱼鱼鳞制备多肽金属螯合物的工艺优化

本文研究并优化了以美国红鱼（Sciaenops ocellatus）鱼鳞为原料制备多肽及合成多肽金属螯合物的工艺条件。以美国红鱼鱼鳞为原料制备多肽,采用凝胶色谱分析多肽的分子量;利用水体系法合成多肽金属螯合物并采用EDTA络合滴定法测定金属螯合率;设计并利用L₉（34）正交试验优化了多肽金属螯合物工艺条件;利用红外光谱检测多肽和多肽金属螯合物,验证多肽与金属的结合。凝胶色谱分析获得多肽分子量在1~6 kDa左右,正交试验获得了多肽金属螯合物的制备工艺条件,即多肽锌螯合物的工艺条件为质量比2:1、pH5.5、温度55 ℃、时间60 min;多肽铜螯合物的工艺条件为质量比2:1、pH6.0、温度35 ℃、时间55 min,在该最佳螯合条件下制备的多肽锌、铜螯合物的螯合率分别为78.21%、91.24%。红外吸收光谱结果显示Zn2+、Cu2+与-NH₂结合成功,表明多肽锌、铜螯合物是新的物质。研究结果表明,该工艺条件下的螯合率明显提高,且富含金属离子、成本低廉、市场前景可观,有利于海洋水产加工副产物高值化应用,促进渔业加工产业的技术升级。     

酶法制备花生粕醒酒多肽

为更合理有效地利用花生粕资源,制备具有醒酒作用的花生粕多肽,本实验以Alcalase AF 2.4L蛋白酶酶法制备花生粕醒酒肽,经分级分离后,通过体外和动物实验验证其醒酒效果。结果表明,花生粕醒酒肽制备最佳工艺条件为：酶解时间3 h、酶解温度35 ℃、pH 9.5及料液比1∶30（m/V）。该条件下乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase,ADH）激活率及多肽得率均较高。经分级分离后,分子质量在1 000～3 000 D的多肽对ADH激活作用最强,激活率为30.47%。G25凝胶色谱分析表明,花生粕多肽中小于3 000 D的多肽占89.55%,ADH激活率为29.25%。动物实验证明,花生粕多肽对小鼠有显著的防醉醒酒作用。小鼠血液乙醇含量测定结果表明,高剂量的花生粕多肽在60～90 min内能显著降低小鼠血液中的乙醇含量。     

呈味肽的制备、纯化与鉴定

采用酶解法以鸡肉为原料进行鸡肉蛋白多肽的制备,通过葡聚糖凝胶柱层析法对混合多肽进行不同分子质量片断的分离,确定最优的分离填料为G25、洗脱液为乙醇-水,在此条件下,分子质量＜1 000 u的组分通过分离富集含量可达100%、分子质量＞5 000 u的组分含量达78%、分子质量1 000～5 000 u的组分含量达70%。通过感官评价、电子舌分析发现,不同分子质量片段多肽提供的风味侧重点不同,分子质量＜1 000 u的多肽热反应产物在醇厚感、嗜好性方面最优。利用高效液相色谱、液质联用仪对该肽段进一步纯化与鉴定,找到其中5条呈味肽,并采用固相合成法制备,经感官评价验证其呈味功能,发现在清水评价中,合成的5条多肽呈味效果以酸、甜、鲜味为主;在鸡粉溶液加香评价中,呈现鲜味最强的多肽为γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly;呈现醇厚感最强的多肽为L-GSH。