缺失ATP合酶和插入VHb基因对钝齿棒杆菌谷氨酸产量的影响

为了提高钝齿棒杆菌生产谷氨酸的产量,以谷氨酸生产菌钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）T6-13为出发菌株,利用同源重组技术使其缺失ATP合酶基因（atp）并进一步插入透明颤菌血红蛋白基因（VHb）,得到两株重组菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb,通过检测重组菌株谷氨酸产量及生长情况可以看出,在发酵32 h后,atp基因缺失菌株较出发菌株谷氨酸产出累积量高27.76%,但atp基因缺失导致菌体生长缓慢且无法到达出发菌株稳定期浓度,而插入VHb基因的atp基因缺失菌株的谷氨酸产出累积量较出发菌株高36.91%,且菌体的生长速率及稳定期浓度与出发菌株基本一致。     

L-精氨酸产生菌发酵培养基及发酵条件优化的初步研究

本文以钝齿棒杆菌诱变菌为实验菌株,采用摇瓶发酵的方式,研究了培养基组分(碳源、有机氮源、无机氮源及无机盐离子)与发酵培养条件(温度、接种量、初始p H及发酵液体积)对菌种产L-精氨酸的产量的影响。结果表明,该菌产L-精氨酸发酵培养基的最佳组分为:葡萄糖12%、硫酸铵4.5%、玉米浆2.5%、KH2PO40.005%、Mg SO4·7H2O0.01%、Fe Cl3·6H2O 0.01%、Mn SO4·H2O 0.05%及碳酸钙3%;最佳发酵条件是:培养温度为30℃、接种量为10%、初始p H为7.0及装液量为15m L/250m L。该菌以最优结果发酵,L-精氨酸的产量较基本培养基提高27.7%,达到了11.23g/L。     

解除硝酸盐呼吸和氮通量限制对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

精氨酸广泛应用于食品、医药和工业领域中，其生产方式主要是微生物发酵法。钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)是精氨酸生产的重要工程菌株。该文针对课题组前期构建的钝齿棒杆菌(CCM01)进行代谢改造，探究了arnR和cgl2482的敲除对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响。采用无痕敲除方法构建工程菌株并对其进行摇瓶发酵，测定菌体生长量、L-精氨酸产量、葡萄糖消耗量考察菌株产L-精氨酸的影响。硝酸盐能提高钝齿棒杆菌在氧气不足时的生长率，并且arnR的敲除有助于L-精氨酸的生产，arnR敲除菌株CCM02较对照菌株产量提高了8.58%,且当硝酸盐浓度在1.5 mmol/L时对积累L-精氨酸最为有利，产量达到17.09 g/L;cgl2482的敲除有助于氮源流入精氨酸合成途径，其敲除菌株CCM03精氨酸产量达到了17.88 g,较对照提高了4.9%;最终在CCM03发酵中添加1 g/L的尿素、50 g/L的谷氨酸钠以及1.5 mmol/L的硝酸盐时，L-精氨酸产量达到22.25 g/L,较CCM01提高了46.8%。     

钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶分析

采用亲和层析和SDS-PAGE方法分析钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶。实验表明此菌产精氨酸关键酶之一是乙酰谷氨酸激酶，其分子量为34kD：同时另一分子量为49kD的蛋白质亦对精氨酸有较高的亲和性，揭示钝齿棒杆菌产精氨酸的代谢途径中受精氨酸抑制的酶不是唯一的。实验对限速酶之一——乙酰谷氨酸激酶的酶学性质做了初步研究，结果显示，此酶的最适反应温度为49℃，最适pH为8．0；金属离了Pb^2 、Cu^2 、Mn^2 和Fe^2 对乙酰谷氨酸激酶有强烈的抑制作用：DTT对该酶的活力有一定的影响。     

谷氨酸发酵生产菌的研究与开发

L-谷氨酸微生物工业化发酵生产已有50余年历史,回顾国内各味精厂曾使用过的菌种,主要是1.天津短杆菌;2.钝齿棒杆菌;3.北京棒杆菌及它们的突变株。[1]目前厂家用葡萄糖发酵所使用的菌种主要为天津短杆菌T613的突变株,     

钝齿棒杆菌ArgR蛋白的表达、纯化及其多聚体的形成

通过PCR技术从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542基因组中扩增得到长度为516bp的argR基因,将其连接到原核表达载体pET22b(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET22b-argR,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在33℃诱导8h实现高效可溶性表达,获得了一个分子质量为20kD的融合蛋白ArgR。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:160000。Western blot分析结果表明,L-精氨酸介导重组蛋白形成的多聚体,可与自制的鼠抗ArgR多克隆抗体进行特异性反应,与预期结果一致,表明ArgR通过与精氨酸共孵育形成了多聚体,该结果有助于采用凝胶阻滞方法对ArgR蛋白与钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中各操作子的结合情况进行进一步研究。     

谷氨酸发酵生产菌的研究与开发

L-谷氨酸微生物工业化发酵生产已有50余年历史，回顾国内各味精厂曾使用过的菌种，主要是1．天津短杆菌；2．钝齿棒杆菌；3．北京棒杆菌及它们的突变株。目前厂家用葡萄糖发酵所使用的菌种主要为天津短杆菌T613的突变株，有FM820；FM84—415；FM-1到FM-20；S9114等，上述生产菌种，主要是通过诱变为主的微生物育种而获得，它的产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产发展获得了很大的提高。但如果在现有产酸能力情况下，继续采用传统微生物育种技术（如诱变、细胞融合等手段）选育菌种，     

吐温对钝齿棒杆菌产L-精氨酸代谢的影响

目的:以课题组构建的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT NAGK M4 △proBANcgl1221AdtsR1(CCM01)为出发菌株,探究吐温(Tween)对该菌产精氨酸代谢的影响.方法:优化精氨酸发酵及Tween质量浓度,测定菌体生长量、L-精氨酸产量、发酵液残糖量考察Tween ...     

野生型与突变型钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇argJBDFR的生物信息学比较

本文设计四对特异性引物分别扩增了野生型和突变型钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR，对其中发生突变的基因argJ、argB及argF的变化进行了生物信息学比较，并分析了这些突变可能对精氨酸产量提高的贡献，为采用基因工程手段改良菌种提供有益的信息和指导。     

钝齿棒杆菌AS1.998原生质体形成与再生条件的研究

研究了影响L-异亮氨酸(L-Isoleucine)产生菌钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998原生质体形成和再生的各个因素。结果表明:菌体培养至对数生长期,0.8 U/mL青霉素G处理3 h后,1.0mg/mL的蛋清溶菌酶37℃,150 r/min酶解15 h,原生质体形成率可达98.0%以上,在含8.5%蔗糖的再生完全培养基上,再生率可达20.0%～30.0%。     

野生型与突变型钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇arg JBDFR的生物信息学比较

本文设计四对特异性引物分别扩增了野生型和突变型钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR,对其中发生突变的基因argJ、argB及argF的变化进行了生物信息学比较,并分析了这些突变可能对精氨酸产量提高的贡献,为采用基因工程手段改良菌种提供有益的信息和指导。     

吐温-80对钝齿棒杆菌产L-赖氨酸的影响

对吐温-80提高L-赖氨酸产量的分子机制进行探究。以钝齿棒杆菌MT-M4 ΔproB为出发菌株,在菌株生长至对数初期36 h时,添加5 mg/mL吐温-80进行摇瓶发酵,通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应（reversetranslate real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）监控相关基因的转录水平、胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form,NADPH）水平及α-酮戊二酸脱氢酶复合物（α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC）的活力。摇瓶发酵结果表明,添加吐温-80使L-赖氨酸产量提高了215%;RT-qPCR结果表明,编码ODHC的基因odhA、sucB和lpdA、参与ODHC调控的基因pknG、dtsR和ppp以及合成NADPH的磷酸戊糖途径基因zwf的转录水平均发生了变化,其中odhA、sucB、lpdA、pknG及dtsR1基因分别发生了上调,ppp基因下调,相应ODHC活力提高了32.9%;zwf基因上调了17.6 倍,相应胞内NADPH水平提高了137%。因此,在对数生长初期36 h添加吐温-80具有双重功效,既提高了ODHC的表达又使NADPH积累,从而诱导L-赖氨酸的高产。     

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.     

酿酒酵母菌株发酵过程中硫化氢产率动态变化研究

利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法和硫化氢检测管检测法分析了高／低产硫化氢酿酒酵母菌株的发酵特性及其硫化氢产生特性。结果显示：高／低产硫化氢酿酒酵母茵株在发酵过程中的硫化氢产率变化趋势同为“双峰”趋势，且发酵前期峰值出现时间相同；高／低产硫化氢酿酒酵母在发酵速率和硫化氢产生比率上存在一定差异，且不同菌株的发酵速率与硫化氢产生比率之间没有必然联系。     

利用薯蓣皂素生产废水发酵生产谷胱甘肽

经过传统工艺酸解盾叶薯蓣得到的皂素生产废水是一类酸性高浓度有机废水,实验主要通过对皂素废水进行了3种不同方式的预处理,实现废水发酵生产谷胱甘肽,同时降低废水COD值的目的。实验表明,3种不同的预处理方式对谷胱甘肽产量影响不同,将纯糖液的谷胱甘肽产率记作100%,处理1,只调节废水pH值,发酵得到的谷胱甘肽产量为0.847 625 g/L,达到纯糖液发酵的54.79%,同时废水COD去除率达57.17%;处理2,先调节废水pH值,然后进行活性炭吸附之后发酵,得到谷胱甘肽产量为0.835 7 g/L,达到纯糖液发酵的55.02%,同时废水COD去除率达77.60%;处理3,先进行活性炭吸附,然后调节其pH之后发酵,得到的谷胱甘肽的产量为0.689 0 g/L,达到纯糖液发酵的44.55%,同时废水COD的去除率达到73.52%。从工业生产成本的角度出发,处理2的方式为最佳方式。     

Characterization of a new keratin-degrading bacterium isolated from deer fur

A keratin-degrading bacterium was isolated from soil containing deer fur. An axenic culture of the keratin-degrading bacterium was obtained in liquid culture using a keratin enrichment technique. The isolated bacterium was gram negative and catalase- and oxidase-positive. Transmission electron microscopic observations showed that the bacterium was rod-shaped, 1.0-1.3 microm long and 0.7 microm in diameter. Phylogenetic analysis of 16S rDNA revealed that the new isolate has only 90.6% homology with Stenotrophomonas nitritireducens. Hence, this new bacterium was designated as Stenotrophomonas sp. D-1. The optimum temperature was determined to be 20 degrees C for maximum growth and keratinolytic enzyme production. Amino acid data, obtained after treating keratin powder with the supernatant culture, suggest that the major free amino acids resulting from keratin degradation are phenylalanine, tyrosine and valine. In addition, native chicken feather was degraded completely at 20 degrees C in 2.5 d by this bacterium.