啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法

建立了一种从酿酒酵母干细胞中高效抽提谷胱甘肽(GSH)的新方法,料液比为1:8,采用醋酸-盐酸调节抽提pH值为3.5,抽提温度(70±1)℃的条件下,GSH抽提量可达5.50 mg/g,比已报道的其它抽提法提高54.49%～62.24 0A.抽提液经微滤(膜孔径0.45、0.22μm)、超滤(膜截留相对分子质量5 000)处理,蛋白质总去除率为60.98%.所得超滤液经高效液相法和氨基酸分析仪分析表明,粗提物中的杂质除蛋白质、小肽外,氨基酸类杂质主要为谷氨酸,为GSH的进一步精制提供了基础数据.     

纯化大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的两种亲和分离介质的研究

建立了从重组菌中高效亲和制备胆固醇氧化酶的方法,将一种源自Brevibacterium sp.(DQ345780)的胆固醇氧化酶基因转入Escherichia co●BL21(DE3)表达,,选择核黄素-5’磷酸(FMN)及7-氯-异咯嗪作为亲和配体,构建胆固醇氧化酶亲和制备介质。通过两种介质的一步亲和吸附,获得纯度较高的胆固醇氧化酶样本,蛋白回收率分别为9.4%与9.9%(质量百分比),活性回收率分别为85.2%与93.4%(活性百分比)。使用SDS-PAGE分析,纯化得到蛋白分子量为约50 000,纯度分别为98.0%与97.5%(纯度百分比)。通过静态吸附分析,胆固醇氧化酶相对两种亲和介质的最大理论吸附值分别为71.0与78.5 mg/g介质;解离常数分别为12.8和7.3μg/g介质。     

黄嘌呤氧化酶酶学性质及共价交联固定化

研究了节杆菌Arthrobacter M3黄嘌呤氧化酶酶学性质,并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶,提高酶热稳定性。研究发现,该酶为异质二聚体,相对分子量为135 000;最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。固定化结果表明,以修饰的琼脂糖介质共价交联固定化的酶热稳定性均优于大孔阴离子交换树脂类,其中以谷氨酸为连接臂的琼脂糖介质(Sepharose-Glu)固定化效果最佳。在50℃下保温3 h,相比于游离酶酶活仅剩余8.0%,Sepharose-Glu介质固定化的酶仍保留48.3%的酶活,半衰期提高了1.6倍,酸碱耐受性亦优于游离酶。     

保护剂对胆固醇氧化酶稳定性机理的研究

利用荧光光谱、圆二色性光谱及凝胶电泳等方法,研究液态胆固醇氧化酶失活机理。根据失活机理,选择添加两种不同保护剂提高酶稳定性,研究提高酶稳定性的机理。37℃下,添加15%甘油的液态酶稳定性较佳,45 h后酶活保留率提高58%,核黄素对酶基本无保护作用。经研究分析,甘油主要通过有效抑制分子间聚集,维持二级结构,增强酶稳定性;核黄素不能抑制酶自身聚集,对酶保护作用不明显。     

分离谷胱甘肽D840树脂的筛选研究

采用D201、201×7、D354、D840、D001、001×7六种树脂,对从啤酒酵母中抽提的谷胱甘肽超滤样液进行静态吸附比较,筛选出D840树脂的吸附容量最高;并初步研究了树脂的洗脱,在1mL/min的流速下,用0.3mol/L的盐酸洗脱,收集洗脱液中谷胱甘肽,回收率为72.08%,纯度为50.5%。     

黄嘌呤氧化酶酶学性质及共价交联固定化

研究了节杆菌Arthrobacter M3黄嘌呤氧化酶酶学性质,并利用修饰的琼脂糖介质及大孔阴离子交换树脂固定化黄嘌呤氧化酶,提高酶热稳定性。研究发现,该酶为异质二聚体,相对分子量为135 000;最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。固定化结果表明,以修饰的琼脂糖介质共价交联固定化的酶热稳定性均优于大孔阴离子交换树脂类,其中以谷氨酸为连接臂的琼脂糖介质(Sepharose-Glu)固定化效果最佳。在50℃下保温3 h,相比于游离酶酶活仅剩余8.0%,Sepharose-Glu介质固定化的酶仍保留48.3%的酶活,半衰期提高了1.6倍,酸碱耐受性亦优于游离酶。     

添加辅酶前体及流加诱导物提高黄嘌呤氧化酶发酵产率

通过对产黄嘌呤氧化酶菌株进行16S rDNA序列分析,构建系统进化树,确定该菌株为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。添加辅酶前体(核黄素、硫胺素)及诱导物(次黄嘌呤,3.6 g/L),提高了发酵产酶;通过两种方式流加葡萄糖及次黄嘌呤,结果表明,发酵至24 h,一次性补葡萄糖质量浓度4.0 g/L,流加次黄嘌呤质量浓度至3.6 g/L,酶产率可达8 952.7 U/L,比未补料时提高25.7%,平均产率系数达1 041.0 U/g。测定流加发酵过程中铵根离子浓度变化,发现一定质量浓度的铵根离子抑制发酵产黄嘌呤氧化酶。