全局转录机制工程法筛选丁醇耐受大肠杆菌及性质

作者旨在采用一种快速有效的方法(全局转录机制工程方法)筛选一株具有较高丁醇耐受性的大肠杆菌。通过对全局转录因子σ~(70)进行随机突变,构建rpoD(编码σ~(70)因子)突变库。并采用高通量筛选的方法筛选获得丁醇耐受突变株E. coli JM109/pHACM~(B8),并对该突变株的性质进行了研究。结果表明:丁醇耐受突变株B8能够耐受体积分数2%丁醇,且对其他有机溶剂也具有较高的耐受性,如体积分数3%异丁醇、体积分数8%乙醇、体积分数4%环己烷和体积分数0.3%甲苯。为进一步阐明了B8菌株丁醇耐受机制,分别对B8菌株和对照菌株E. coli JM109/p HACM~(WT)的生理特性进行了研究。结果显示突变株B8胞内的丁醇含量较对照菌株低55%;且在酸性环境下比对照菌株生长更好;此外Mg~(2+)有助于提高菌株B8的丁醇耐受性。本研究为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。     

ClostridiumsaccharobutylicumDSM13864细胞表面理化特性及固定化细胞产丁醇的性能

糖丁基梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864能利用多种糖类为底物发酵产丁醇。本文研究了该菌体细胞表面的理化特性,并以砖块作为细胞固定化材料进行丁醇发酵。采用细菌吸附有机溶剂(MATS)法证明糖丁基梭菌细胞表面有强烈的亲水性,并且等电点在pH值为3左右,这些特性有利于菌体与表面亲水多孔的砖块吸附。在60g/L葡萄糖发酵培养基中,以5～8目砖块作为固定化材料,流速为1.1L/min,发酵48h后,丁醇的浓度、得率和生产率分别达到11.02g/L、0.18g/g和0.23g/(L·h),相比悬浮细胞发酵分别提高了10.53%、5.88%和9.52%。结果表明:砖块作为一种固定化材料可有效提高糖丁基梭菌的发酵产丁醇水平。     

优化黑曲霉柠檬酸生产菌株原生质体形成条件及表达系统的建立

优化了黑曲霉柠檬酸生产菌株的原生质体形成条件并建立基因表达系统。利用酶解法制备原生质体,最优的酶解液配比为5 mg/m L溶壁酶、0.2 U/m L几丁质酶和460 U/m L葡萄糖醛酸酶。最优的渗透压稳定剂为0.7 mol/L KCl,菌丝层厚度50μm,菌体量为0.003 g/m L。在培养基中添加1 mmol/L Mn2+有助于减少原生质体形成所需的酶量,在培养基中添加葡萄糖醛酸酶有助于得到独立的孢子进行萌发,从而促进原生质体的形成。利用共转化的方式,可以同时将两个表达框整合到基因组上并实现基因表达。     

恶臭假单胞菌的正丁醇耐受性驯化及比较基因组学分析

恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一类非常重要的工业微生物,广泛用于环境修复、生物活性物质合成等方面。作者采用常压室温等离子体诱变技术（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）对实验室保藏的恶臭假单胞菌901进行随机诱变,以正丁醇作为筛选压力进行驯化培养,最终筛选得到一株能耐受12 g/L正丁醇的突变株。通过Illumina HiSeq平台进行全基因组重测序和生物信息学分析。结果显示共获得大约1 900万对reads,平均读长为150 nt,与参考基因组的片段配对率为92.03%,覆盖率为90.34%。共检测到40 704个单核苷酸位点变异（singlenucleotide variation,SNV）,其中纯合的为39 319个,杂合的为1 385个;存在2 153个基因小片段插入/缺失序列（insert & deletions,InDels）,其中纯合的突变位点数量为1 871个,杂合的突变位点数量为282个。最后,将所有突变进行GO/KEGG数据库功能注释,发现突变数目最多的是代谢相关基因,其中以氨基酸代谢和糖代谢路径相关基因为主。     

乳酸菌和酵母共培养技术缩短郫县豆瓣酱陈酿期的应用研究

耐盐乳酸菌和酵母菌接种到郫县豆瓣的酱醅中共培养,陈酿8个月后,试验组的总酯显著增加,接近自然陈酿12个月的水平,氨基睃态氮、总酸等理化指标无显著筹异.通过HS-SPME耦联GC-MS技术榆测4个月和8个月陈酿酱醅挥发性组分的分析结果表明,十四烷酸、十六碳酸、棕榈酸、亚油酸和15-甲基-十七(碳)酸的乙酯衍生物等酯香主体成分成倍增加.Glu、Asp、Ser、Thr、Ala等对呈味有显著影响的组分也有较人增幅.研究结果表明,乳酸菌和酵母菌的协同作用具有促进酯化,呈味氨基酸形成及抑制杂菌的作用,对其风味改善贡献显著.     

产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性

为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。     

角蛋白酶生产菌种选育及脱毛应用的研究

以可溶性角蛋白为诱导底物,采用综合CS/CZ比值、活力大小与脱毛效果的集成定向诱导选育技术,从制革污水样品中,筛选到脱毛效率高的角蛋白酶野生菌株.应用菌落形态特征、部分生理生化、Biolog菌种鉴定系统和基于16SrDNA的分子生物学方法等多相分类鉴定技术鉴定,确定该分离株为Bacillus cereus,并命名为Bacillus cereus B-8.其粗酶液应用于绵羊皮脱毛实验的结果表明,该酶液可取代硫化碱,高效地使绵羊皮脱毛.应用组织形态学方法对脱毛机理的探讨表明,酶是沿毛干渗透到毛根部,破坏毛囊与毛袋、毛球与毛乳头之间的联结组织,削弱其联结,随后借助机械作用,使毛脱离表皮,实现无硫脱毛的目的.研究结果表明该分离株是开发无硫生物助剂生产技术的候选微生物菌株.     

红曲霉培养条件对酯化力影响的研究

以A13、As3.554和As3.972为研究对象,比较了其培养参数米坯的初始水分、培养时间及以葡萄糖和蔗糖为速效碳源及添加量对底物己酸和乙醇转化为脂肪酸酯的酯化力的影响规律.实验结果表明.蒸米坯的初始水分、培养时间对其酯化力均有显著的影响,其最适水分为50%,培养时间为24d,葡萄糖可作为其培养初期的速效碳源,添加量视其菌株性能而存在一定差异.HS-SPME耦联GC-MS剖析不同红曲菌株制成的曲粉所催化得到的产物组分表明,其主要产物与总酯化力之间存在相关性,其酯化物的种类取决于菌株的特性.     

角蛋白酶在牛皮脱毛工序中的应用研究

Bacillus cereus SZ-4粗酶液在牛皮的脱毛试验结果表明:它能有效降解毛囊与毛干联接部位的组分,除去纤维间质和松散胶原纤维。因为能够取代硫化碱,Bacillus cereus SZ-4将成为开发无硫生物脱毛助剂生产技术有潜力的菌株。未经软化工序处理的样品加工成革后,其感官性能和物理性能与毁毛法处理的样品无显著差异,进一步优化了脱毛和浸灰工艺,有望省略软化工序。并且,样品处理废液中BOD5、COD、TOC等主要污染指数明显降低,实现了环保的目的。     

可得然胶生产菌种的筛选及发酵条件优化

采用苯胺蓝平板筛选法从土壤中筛选并鉴定了一株产可得然胶的根瘤菌,并对该菌株发酵合成可得然胶的培养基进行优化。在单因素优化的基础上,设计4因素3水平的正交优化方案,优化结果显示,该菌株发酵产可得然胶的最优培养基组成为:葡萄糖50 g/L,(NH4)2HPO42g/L,KH2PO41.5 g/L,Mg SO41.25 g/L,Fe SO4·7H2O 0.05 g/L,Mn SO40.02 g/L,Co Cl2·6H2O 0.01 g/L,Zn Cl20.01 g/L。经摇瓶发酵验证,可得然胶的产量和糖转化率较优化前分别提高了29.2%和5.4%,为进一步利用该根瘤菌发酵合成可得然胶奠定了良好基础。