传统培养法与荧光PCR法检测弧菌的方法评价

目的比较标准检测方法与杜邦BAX System Q7快速检测方法检测副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌。方法采用GB 4789.7—2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》、SN/T 1022—2010《进出口食品中弧菌霍乱弧菌检验方法》、DBS 13/004—2016《食品安全地方标准创伤弧菌检验》标准和杜邦BAX System Q7系统操作方法对1份同时污染副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的样品进行检测。结果BAX System Q7操作方法与标准操作方法检测结果一致,其中BAX System Q7可同时检测3种弧菌,用时20 h,而标准操作方法至少需要6 d。结论BAX System Q7检测方法与标准方法均具备高准确性,但相较于标准检测方法,BAX System Q7检测方法鉴定更快速、操作更简便,且3种弧菌可以同时鉴定。     

杭州市1株不产毒霍乱弧菌食品分离株的基因组特征与溯源研究

目的 研究杭州市1株不产毒小川血清型霍乱弧菌食品分离株与国内外食品和临床分离株的溯源关系及其分子特征。方法 采用荧光定量聚合酶链式反应检测菌株毒力基因分布,使用高通量测序获得基因组序列,使用生物信息学方法鉴定其多位点序列分型（MLST）型别。将101株食品和临床分离株基因组序列比对到参考基因组N16961获得单核苷酸突变位点（SNV）,去除重组并构建进化树,分析食品分离株和近源菌株的基因分布情况。结果 该食品分离株是不产霍乱毒素和产毒素共调菌毛的霍乱弧菌（CNTP）,MLST分型结果为ST1480,与杭州地区流行的ST75型CNTP菌株属于同一克隆群。该菌属于进化树L3b. 1分支,与杭州2011年临床分离株（HZ11-1,HZ11-2）高度同源,去除重组后仅有26个SNVs位点差异。结论 从甲鱼涂抹拭子中检出与杭州地区流行的CNTP高度同源的菌株,杭州地区散发病例感染来源可能与爬行类食品污染因素有关,应加强对其养殖场所及销售场所进行消毒。     

基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法

选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。     

霍乱弧菌基质辅助激光解吸飞行时间质谱数据库的建立与应用

目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)快速检测霍乱弧菌,并建立数据库。方法考察培养基、培养时间、培养温度以及样品前处理方法对图谱质量和鉴定结果的影响,对方法的稳定性、重复性进行研究;采集101株霍乱弧菌食品分离株MALDI-TOF-MS指纹图谱,并对图谱进行分析。其中标准菌株CICC23794及40株分离株作为建库菌株,其余60株用于建库后的测试。结果采用2%NaCl-TSA培养基,在37℃、24h条件下培养,可达到强峰值信号,谱图重现性良好,甲酸-乙腈提取法获得的质谱图特征峰多,信噪比高;建库后, 60株霍乱弧菌均可达到高于2.0的水平,其中约有20株霍乱弧菌鉴定分值可达到2.4以上。结论本研究建立的霍乱弧菌MALDI-TOF-MS鉴定方法结果准确,可用于实际检测。     

北京一起副溶血性弧菌和非O1/O139霍乱弧菌共感染导致急性胃肠炎暴发事件病原检测分析

目的 对一起副溶血性弧菌和非O1/O139霍乱弧菌共感染导致急性胃肠炎暴发事件进行实验室病原学分析。方法 采用实时荧光PCR方法对4个病例肛拭子、12件可疑污染食品和8件环境涂抹的增菌液进行多种腹泻病原检测,将副溶血性弧菌和霍乱弧菌分离培养,并对分离株进行全基因组测序,获取菌株毒力基因和耐药基因,基于核心基因组单核苷酸多态性构建聚类树。结果 4件病例肛拭子增菌液荧光PCR检测副溶血性弧菌结果均为toxRVP+/tdh+/trh-,其中2件肛拭子荧光PCR检测霍乱弧菌结果为阳性。病例肛拭子副溶血性弧菌培养法检出率为100%(4/4),分离株均为toxRVP+/tdh+/trh-,血清型均为O4:KUT;病例肛拭子霍乱弧菌培养法检出率为50%(2/4),均为非O1/O139血清型,其中1分离株为toxR_VC+/ctx-/t3ss+。可疑污染食品副溶血性弧菌培养法检出率为66.67%(8/12),环境涂抹副溶血性弧菌检出率为12.50%(1/8),可疑污染食品和环境副溶血性弧菌分离株均为toxRVP+/tdh-/trh-;可疑污染食品霍乱弧菌检出率为25.00%(3/1...     

抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定。方法以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株。对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验。与细菌培养法对比检测208份临床标本。结果6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38×107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应。6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%。结论制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂。     

五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立

用DNAStar软件对GenBank中沙门氏菌的侵袭蛋白invA基因、单增李斯特菌的Hly基因、金黄色葡萄球菌的sa442基因、霍乱弧菌的hlyA基因、副溶血弧菌toxR基因进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针和引物,并标记生物素、探针,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与相应的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号,建立沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病菌基因的PCR产物反应,检测灵敏度达到50~100copies/mL。该方法的建立为其它致病细菌和病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。     

蛭弧菌的分离鉴定及其对非O1霍乱弧菌的消除作用研究

从海洋环境中分离到2株蛭弧菌(A-1和A-2),研究了其对6株不同来源非O1霍乱弧菌的消除作用,以探索其对由非O1霍乱弧菌所引起的腹泻疾病的预防效果。实验结果表明,在20～35℃温度条件下,蛭弧菌均有较好的裂解效果,30℃时裂解能力最强;在pH6.5～8.1条件下,蛭弧菌均有较好的裂解能力,pH为7.2时,达到最佳裂解效果;A-1能裂解其中5株非O1霍乱弧菌,A-2能裂解其中4株非O1霍乱弧菌,而2株蛭弧菌协同作用,能全部裂解6株非O1霍乱弧菌。本研究结果揭示了蛭弧菌作为生物消除剂在预防由非O1霍乱弧菌所引起的腹泻疾病方面具有潜在应用价值。     

两种致病性弧菌二重LAMP-熔解曲线检测方法的建立

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了食品中产毒素性霍乱弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲线快速检测方法。本方法针对产毒素性霍乱弧菌ctx A基因和副溶血性弧菌gyr B基因分别设计引物组进行二重LAMP扩增,并利用熔解曲线法分析扩增产物,从而判断DNA模板中所含目标菌。应用本方法对9株目标菌和17株非目标菌的检测结果与预期一致,并可通过熔解曲线的特征峰准确分析DNA模板中所含目标菌。对二重LAMP扩增产物的测序分析表明,扩增所得序列与目的基因序列吻合,从而进一步验证了该方法的特异性。经测试,本方法对两种目标菌的检测灵敏度均可达100 fg DNA/反应管。实验证明所建立的方法具有良好的特异性,并可为食品中两种致病性弧菌的快速检测提供一种重要技术手段。     

非O1群霍乱弧菌O139型荚膜多糖的制备及生物学特性

目的 提取Ｏ１３９型霍乱弧菌荚膜多糖,并检测其理化特性及免疫原性。方法 采用Ｃａｔａｖｌｏｎ、冷 酚、不同浓度乙醇沉淀、离心等步骤精制Ｏ１３９霍乱弧菌荚膜多糖,用生物学、免疫学等方法分析检定。结果 提取 的霍乱Ｏ１３９型荚膜多糖具有良好的多糖特性、结构特征和免疫原性。结论 为组分疫苗的研制打下基础。