柯萨奇病毒A组16型G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学

目的探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学。方法常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1 MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同温度和pH维持液中进行培养,每2 h收样1次至第24 h,以48 h收样作为对照样,微量滴定法检测病毒滴度,并绘制增殖动力学曲线。结果 G20株病毒在Vero及KMB-17细胞中传代适应后,均可导致细胞病变。G20株病毒在此两种细胞中培养,pH 6.0、pH 6.5时,不同培养温度下,病毒基本不增殖;pH 7.5与pH 7.0的病毒增殖基本一致,增殖速度随温度呈现37℃>35℃>33℃的趋势;在33℃～37℃、pH 7.0～8.0时,病毒均有不同程度的增殖;在41℃、各pH条件下,病毒增殖均明显受到限制。结论病毒在此两种细胞中,37℃,pH 7.5培养条件下,增殖速度及滴度均较理想。     

不同批次肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗的一致性分析

目的分析不同批次的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)全程免疫后免疫原性及安全性的一致性。方法检测3批EV71灭活疫苗成品的抗原含量、游离甲醛含量、铝含量、内毒素含量、抗生素残留量,并免疫动物检测异常毒力及效力。采用随机、双盲的方法,将3批疫苗于第0、28天分别免疫900名6~72月龄的受试人群。于接种前(第0天)、完成2剂疫苗接种后28天(第56天),采集静脉血,分离血清,采用微量细胞病变法检测EV71中和抗体(neutralizing antibody,Nab)效价;于每次接种后30 min内记录即时反应,每剂接种后0~7 d内记录各种征集性局部和全身症状,0~28 d内记录非征集性不良反应事件,并在整个观察期间报告严重不良反应事件。结果 3批EV71灭活疫苗成品的各项检定结果均在合格范围内。经2剂EV71灭活疫苗全程免疫后,20120101、20120102和20120203批疫苗受试者的抗体阳转率分别为98.00%、95.67%和98.67%,易感人群(Nab<1∶8)免后抗体阳转率分别为96.45%、92.44%和97.60%,非易感人群(Nab≥1∶8)免后抗体水平的4倍增长率分别为67.94%、65.63%和71.43%;免后抗体GMT分别为283.79、231.48和285.78,组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。3批疫苗诱导的与疫苗相关的不良反应及严重不良反应事件,组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过比较3批疫苗的各项生产质量控制指标及其诱导的抗体水平,证实该疫苗的生产工艺较稳定。     

腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果

目的观察腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果。方法SP株腮腺炎病毒液经灭活、浓缩、裂解后,采用SP SepharoseTM Fast Flow阳离子层析柱及Sepharose CL-4B分子筛层析柱纯化,收集各峰样品,经12%SDS-PAGE、Western blot分析及HPLC检测。并取第1峰样品免疫ICR及BALB/c小鼠,检测血清中和抗体效价及CTL杀伤活性。结果所收集的第1峰样品为单一的腮腺炎病毒蛋白组分。免疫ICR小鼠可诱导产生中和抗体,其免疫后各检测时间点的GMT水平与减毒活疫苗组相比,差异均无统计学意义;免疫BALB/c小鼠可诱导产生针对HN肽段的CTL杀伤活性,而减毒活疫苗组则未能诱导此特异性CTL反应。结论腮腺炎病毒蛋白组分疫苗在小鼠体内可诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答,为新型腮腺炎疫苗的研制提供了实验依据。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白在人支气管上皮细胞中对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响

目的探讨肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsakievirus A 16,CA16)VP1蛋白在人支气管上皮细胞中对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响。方法经RT-PCR法扩增EV71和CA16的VP1序列,插入至载体pcDNA3. 1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA-EV71-VP1和pcDNA-CA16-VP1。分别转染人支气管上皮细胞16HBE,于转染后24、48和72 h收集样本,进行细胞内天然免疫相关信号分子表达的检测和刺激T细胞增殖的检测。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒pcDNA-EV71-VP1和pcDNA-CA16-VP1构建正确。与阴性对照组比较,EV71-VP1组IFNγ、OX40L、RANKL、TNF-α和IL-2的水平上调,而CA16-VP1组的上调幅度较小。EV71-VP1及CA16-VP1组16HBE细胞的胞内外提取物均可明显刺激分泌IFNγ的T细胞增殖(P 0. 05)。结论 EV71和CA16 VP1蛋白在人上皮细胞16HBE中表达后,可差异性诱导细胞中天然免疫信号分子表达及相似的非特异性刺激T细胞增殖能力。     

人结缔组织生长因子的透皮吸收实验

目的研究人结缔组织生长因子的透皮吸收。方法应用氯胺T法制备125I-人结缔组织生长因子(125I-rCTGF),采用家兔进行不同剂量的125II-rCTGF的完整皮肤和破损(烫伤)皮肤吸收试验。结果125I-rCTGF的比活度为2.0×105计数/(分.μg)。皮肤吸收试验表明,不同剂量125I-rCTGF透皮给药后家兔均未能通过皮肤经毛细血管吸收入血。结论为重组人CTGF临床试验提供必要的实验数据。     

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的应用丙型肝炎病毒多表位抗体,探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原(HCAg)的可能性,为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法利用原核系统表达的丙型肝炎病毒(HCV)7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物,制备抗-HCV多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg,并与RT-PCR法进行比较。结果制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性,Cutoff值为0·239,批内CV值为5·60%~6·65%,批间CV值为7·80%。与RT-PCR比较,相关系数为0·816,灵敏度为88·89%,特异度为96·30%,一致性为95·24%,调整一致性为90·82%,阳性预测值为80·00%,阴性预测值为98·11%。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV-C抗原检测试剂盒差异无显著意义(P=0·06)。结论用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg,具有灵敏、特异、快速的优点,有望开发成为HCAg诊断试剂盒。     

不同温度培养的3株EV71毒株的增殖动力学分析

目的对不同温度培养的3株EV71中国流行株的增殖动力学进行分析。方法分别在32、35、37和40℃条件下对FY23、K9和S1株EV71进行传代培养、2～24h培养及噬斑培养,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;传代培养的子代病毒通过脑内注射方式感染新生ICR乳鼠,观察病毒的致病性。结果传代培养时,在32和40℃培养的3株病毒致细胞完全病变时间较35和37℃延长,且子代病毒滴度下降,35℃培养的病毒滴度较37℃升高;3株病毒培养24h后,37℃培养的病毒增殖效率最高,35℃次之,40℃最低;4个温度培养的病毒噬斑形态无明显变化;新生乳鼠脑内注射致死率差异无统计学意义(P>0.05)。结论培养温度的变化可影响EV71的致细胞病变速度及子代病毒的增殖,但对病毒噬斑的形态及新生乳鼠的致病能力无明显影响。     

HCV/HBV联合抗原免疫原性研究

目的 探讨HCV/HBV联合抗原PCX/S免疫原性。方法 将纯化的HCV复合多表位抗原蛋白PCX与HBV的S蛋白按一定比例混合并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTL杀伤作用。结果 免疫后5、10及15μg的3组均能诱导抗-HBsAb和抗-HCVAb,但抗HCVAb水平明显低于抗-HBsAb水平。免疫小鼠可诱发针对PCX或S蛋白的CTL反应,前者更明显,并刺激T细胞增殖。结论 HCV/HBV联合抗原PCX/S蛋白可诱导特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性

目的观察不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性。方法选取腮腺炎病毒SP-A株在KMB17细胞上传至15、20、30代的活病毒作为实验组,在Vero细胞上传至第2代的病毒作为野毒株对照组,分别接种恒河猴腮腺。观察实验动物体温和临床体征。活体取双侧腮腺,进行组织病理检查,并检测腮腺炎病毒中和抗体。结果对照组动物出现了明显的体温升高,一般状况较差,注射后第5天出现腮腺肿大,组织病理检查表现为淋巴细胞大量浸润。而各实验组动物均未出现腮腺炎症状和明显的组织病理学变化。各组动物接种病毒后均能产生抗腮腺炎病毒的中和抗体,但对照组的中和抗体GMT水平均高于各实验组。结论腮腺炎病毒SP-A株传至第15代次,已无致腮腺炎发病能力,为开发F基因型腮腺炎病毒减毒活疫苗奠定了基础。     

HCV多表位抗原的选择及结构分析

目的：设计HCV复合多表位抗原,分析其空间结构,探讨其用于疫苗研究和HCV-Ag检测的潜在可行性。方法：选择HCV多表位抗原并将其串联成HCV复合多表位抗原基因B2,利用软件和网站分析其空间结构。结果：该HCV复合多表位抗原具备涵盖多种天然表位的抗原特性,且二级结构提示具有形成T细胞位点的倾向,易于诱导T细胞介导的细胞免疫应答,三级结构有良好的亲水性,可能激发良好的体液免疫应答。结论：该HCV复合多表位抗原选择合理,空间结构分析能激发良好的免疫反应,有望用于疫苗研究和HCV-Ag检测。