重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

重组李斯特菌细胞溶解素LLO蛋白表达纯化及溶血活性鉴定

目的克隆单核细胞增生症李斯特菌细胞溶解素O(LLO)基因hlyA,构建其原核表达系统,鉴定融合蛋白LLO的抗原性和溶血活性。方法采用PCR技术从Lm总DNA中扩增hlyA基因,与基因库中其它9株hlyA基因序列相比较。用pET30a载体构建LLO原核表达质粒pET30ahlyA,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用IPTG诱导表达,Ni2+柱纯化后,Westernblot鉴定其抗原性。用人红细胞检测溶血活性。结果所克隆的hlyA基因PEST样结构与GenBank上9个菌株的相应氨基酸序列相比,最多有3个氨基酸替代。LLO融合蛋白在大肠杆菌中可高效表达,纯化后获得高纯度的重组蛋白,具有较高的抗原性。在酸性pH5.5条件下,LLO溶血活性最大为1.41×104HU/mg。结论已成功构建LLO原核表达系统,所表达的蛋白具有较高的抗原性和溶血活性。     

cDNA cloning and characterization of Type V/XI procollagen α1 chain in the skate, Raja kenojei

The full-length cDNA of the Type V/XI procollagen α1 [pro-α1(V/XI)] chain was determined by the RACE technique, using a cDNA library constructed from the 4-week embryo of the skate, Raja kenojei. The expression property and phylogenetic analysis confirmed that the skate pro-α1(V/XI) chain was close to other vertebrate pro-α1(V) chains rather than pro-α1(XI) chains. The present study is the first evidence for the primary structure of full-length cDNA of the pro-α1(V/XI) chain in an elasmobranch.     

中国庚型肝炎病毒NS3区部分基因的克隆与基因特点的分析

利用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从我国一输血后丙型肝炎病人血清中克隆到了庚型肝炎病毒ＮＳ３区的部分基因。经序列分析表明：我国庚型肝炎病毒ＮＳ３区与已知的ＧＢＶ－Ｃ及ＨＧＶ的核苷酸同源性在８１．７—８８．０％之间，而氨基酸同源性均大于９６％，氨基酸序列与ＨＣＶ、ＧＢＶ－Ａ、ＢＧＶ－Ｂ具有一定的结构相似性及数个共有的保守位点。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及原核表达

目的构建猪血凝性脑脊髓炎病毒株(67N)血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)原核表达系统,为建立特异性免疫学诊断方法提供备选材料。方法克隆猪血凝性脑脊髓炎病毒(67N)HE蛋白抗原表位富集区基因,构建重组表达质粒pET-HE,并在大肠杆菌中诱导表达。经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化HE蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测。结果大肠杆菌可高效表达HE蛋白,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42.2%。纯化后蛋白浓度为0.6 mg/ml,纯度为85.4%。所表达的蛋白可被兔抗猪血凝性脑脊髓炎阳性血清所识别。结论已成功构建猪血凝性脑脊髓炎病毒HE蛋白原核表达载体,重组HE蛋白抗原具有良好的特异性,可作为检测猪血凝性脑脊髓炎病毒血清抗体的候选抗原。     

羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。