西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。     

植物乳杆菌组氨酸脱羧酶基因的克隆及序列分析

目的克隆植物乳杆菌组氨酸脱羧酶(Histidine decarboxylase,HDC)基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中登录的乳酸菌HDC基因序列设计引物,提取植物乳杆菌Uvs44基因组DNA进行PCR扩增及克隆,并与其他乳杆菌HDC基因的核苷酸序列进行同源性分析。结果克隆的植物乳杆菌HDC基因大小约为900bp,其核苷酸序列与Lactobacillus sakei同源性最高,为99.9%;与Lactobacillus buchneri的同源性最低,为89.1%。32～489bp为高变区序列,T和C发生的替换较多。结论为产组胺乳酸菌的检测提供了理论依据,也为构建HDC基因缺失工程菌奠定了基础。     

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

目的克隆人NIRF基因,构建其真核表达质粒,并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术,从HeLa细胞中扩增NIRF基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U,并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA;重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后,可见约2400bp的目的片段;测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基,主要位于蛋白空间构象的表面;1Z6U片段含有Ring finger结构域,具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA,构建了其真核表达质粒,并利用生物信息学方法,初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达

目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染BHK细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为有效调控烟草类胡萝卜素的合成代谢,从普通烟草中克隆到与植物类胡萝卜素合成代谢相关的β-胡萝卜素羟化酶基因BCH,以辣椒BCH基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码BCH基因的cDNA序列,暂命名为NtBCH1(GenBank登录号JQ410446)。NtBCH1包含一个完整的开放阅读框,编码309个氨基酸,具备脂肪酸羟化酶超家族保守结构域。序列比对结果表明,NtBCH1蛋白与其他植物的BCH蛋白具有很高的相似性。系统进化树分析表明,NtBCH1与番茄的亲缘关系最近。     

重组李斯特菌细胞溶解素LLO蛋白表达纯化及溶血活性鉴定

目的克隆单核细胞增生症李斯特菌细胞溶解素O(LLO)基因hlyA,构建其原核表达系统,鉴定融合蛋白LLO的抗原性和溶血活性。方法采用PCR技术从Lm总DNA中扩增hlyA基因,与基因库中其它9株hlyA基因序列相比较。用pET30a载体构建LLO原核表达质粒pET30ahlyA,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用IPTG诱导表达,Ni2+柱纯化后,Westernblot鉴定其抗原性。用人红细胞检测溶血活性。结果所克隆的hlyA基因PEST样结构与GenBank上9个菌株的相应氨基酸序列相比,最多有3个氨基酸替代。LLO融合蛋白在大肠杆菌中可高效表达,纯化后获得高纯度的重组蛋白,具有较高的抗原性。在酸性pH5.5条件下,LLO溶血活性最大为1.41×104HU/mg。结论已成功构建LLO原核表达系统,所表达的蛋白具有较高的抗原性和溶血活性。     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建

目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。