人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化。对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB_(17)、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,f HAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2。结果优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法最低可检测出10~(-1)fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测生产用细胞KMB_(17)及Vero工作种子批、OPV收获液、f HAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性。     

不同材质细胞培养容器培养甲型肝炎病毒的比较

目的比较中性玻璃转瓶和聚苯乙烯细胞工厂两种材质的培养容器培养人二倍体细胞和甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的差异。方法采用相同的培养条件,在中性玻璃转瓶和聚苯乙烯细胞工厂中分别培养人胚肺二倍体细胞KMB17,并接种HAV H2株,倒置光学显微镜下观察细胞的形态变化;细胞接种病毒后第0、7、14、18、22、26、30天时取样,ELISA法测定病毒的感染性滴度,分析病毒的增殖动力学。结果两种材质的容器培养的KMB17细胞的生长状态和形态无明显差异;HAV H2株增殖动力学相似;单位体积病毒收获液中的病毒产量无显著差异;聚苯乙烯细胞工厂培养的HAV的单位培养容积产量是中性玻璃转瓶的7.28倍。结论聚苯乙烯细胞工厂和中性玻璃转瓶培养的人二倍体细胞和HAV均能良好生长,细胞工厂可替代转瓶成为新的疫苗规模化生产的细胞培养技术。     

PEG沉淀HAV的最佳条件

本报告用ELISA法检测PEG对HAV的沉淀效果，探索影响沉淀的主要因素及最适条件。将HAV—H2株病毒接种于KMB－17细胞，培养28天收获，超声波破碎释放病毒，用0．01mol／LMPBS稀释至适当浓度，调pH至一定值，加入PEG－6000及NaCl至所需浓度，混句后分别装于离心管中，每一实验组10管，放置于所需温度一定时间，按设定条件离心，去上清液，沉淀用220μl0.01mol／LPBS悬浮，用ELISA法检测，以A值来确定沉淀效果，然后进行统计学处理分析。按此方法我们以】0％PEG－0．40mol／LNaCI、4C放置过夜、10，000gX30’为出发条件，逐…     

两种方法制备甲乙肝联合疫苗的效果比较

目的　观察两种不同方法制备甲乙肝联合疫苗的效果。方法　将甲肝抗原和乙肝抗原分别加Al(OH) 3吸附后混合 ,制备甲乙肝联合疫苗 (方法 1)或将甲肝抗原与乙肝抗原等量混合后 ,加Al(OH) 3吸附 ,制备甲乙肝联合疫苗 (方法 2 ) ,并进行吸附效果、理化性质及效力检测。结果　两种方法制备的联合疫苗理化性质稳定 ,免疫效果良好 ;方法 2制备的联合疫苗其小鼠效力优于方法 1(方法 1甲肝ED50 为 4 2 .0 9EU ml,方法 2为 8.2 0EU ml,P =0 .0 10 )。结论　两种方法制备的联合疫苗均达到了单价疫苗的免疫效果 ,方法 2优于方法 1     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

hsa-miR-22-3p和hsa-miR-671-5p靶标基因的预测及其与癌症患者生存率的相关性

目的通过生物信息学方法预测在m6A去甲基化酶FTO敲低处理后,存在m6A修饰并显著下调的mi RNA(hsa-mi R-22-3p和hsa-mi R-671-5p)的靶标基因,并分析它们与癌症患者生存率的相关性。方法利用在线数据库寻找目标mi RNAs的靶基因,并通过基因功能(gene ontology,GO)和信号通路数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)对这些靶基因的分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological processes,BP)、细胞组分(cell component,CC)定位以及参与的信号通路进行分析;通过蛋白质互作网络(protein-protein interaction,PPI)筛选出核心基因,并分析它们与癌症患者生存率之间的相关性。结果 hsa-mi R-22-3p和hsa-mi R-671-5p共有198个相同的靶标基因;GO分析结果表明,这些靶基因在生物过程中显著丰富,包括肌动蛋白细胞骨架组织、神经元干细胞群维持、对尼古丁的行为反应;对于分子功能,这些靶点富含锌离子结合、蛋白质结构域特异性结合、核心启动子序列特异性DNA结合;细胞成分定位分析还显示,这些靶标在高尔基体的早期内体,细胞连接和整体成分中显著丰富;KEGG通路分析显示,这些交叉基因靶点在非小细胞肺癌、癌症中的胆碱代谢和粘蛋白型聚糖生物合成途径中富集;基于网络的工具分析显示,hsa-mi R-22-3p和hsa-mi R-671-5p已经它们的核心靶标基因RHOU和UNC5B与肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)、肝癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)、肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、低级胶质瘤(low-grade gliomas,LGG)、胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、卵巢癌(ovarian serous cystadenocarcinoma,OV)、肉瘤(sarcoma,SARC)、膀胱癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)、皮肤癌(skin cutaneous melanoma,SKCM)、乳头状肾细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)和乳腺癌(breast invasive carcinoma,BRCA)等11种癌症有关。结论当去甲基化酶FTO被敲低或处于低活动水平时,一些mi RNA和基因可能在癌症中发挥不同的作用,也有可能成为治疗癌症的新的核酸靶点。