重组Thermus thermophilus DNA聚合酶表达纯化及其在RT-PCR中的应用

目的研究重组ThermusthermophilusDNA聚合酶的表达、纯化和应用。方法提取Thermusthermophilushb8基因组DNA作为模板,PCR扩增TthDNA聚合酶基因后,克隆至pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用His-BindQuickCartridge300纯化重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白。提取Thermomonosporafusca总RNA,用一管法RT-PCR扩增E2cd基因,检测重组TthDNA聚合酶RT-PCR活性。结果大肠杆菌表达TthDNA聚合酶,分离出的电泳纯重组TthDNA聚合酶His-tag融合蛋白相对分子质量为94000,表达产量为200000U/L。一管法RT-PCR可扩增出850bp长度的E2cd基因。结论重组TthDNA聚合酶已成功地表达和纯化,并用于RT-PCR。     

应用pCYB1载体表达胰高血糖素

目的 研制基因工程胰高血糖素。方法 利用pCYB1表达载体,亚克隆胰高血糖素基因后转化于BL21（DE3）菌种,并对阳性克隆的质粒进行DNA测序。检测不同条件下,IPTG诱导胰高血糖素-intein-几丁质结合结构域（CBD）组成的融合蛋白表达量,确定工程菌表达最适条件。利用几丁质结合柱进行亲和层析,在DTT作用下由intein在柱上进行自我切割,纯化胰高血糖素。SDS-PAGE检测融合蛋白表达量,SDS-PAGE在Tris-Tricine缓冲系统中电泳检测纯度,Lowry法检测蛋白质含量,Western blot检测免疫原性,升血糖实验检测活性并进行 N-末端测序。结果DNA测序显示表达产物基因序列正确,纯化胰高血糖素具有免疫原性和生物学活性,N-端15个氨基酸与天然产品相同,电泳呈单一谱带,产率为1.25mg/L。结论 获得分泌胰高血糖素基因工程菌,适于快速大规模生产。