睫状神经营养因子突变体的克隆、表达、纯化及生物学活性

目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。     

毛细管SDS无胶筛分电泳测定小分子多肽相对分子质量

目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法(SDS-NGS),测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管(管长30cm,内径100μm);分离电压为9kV(300V/cm),分离温度为20℃;检测波长为214nm,检测时间为18min;所用SDS-多肽相对分子质量标准范围为2 512~16 949;以橙G(OG)为内标参照物。结果在相对分子质量2512~16949范围内,多肽相对分子质量的对数与其相对迁移率具有良好的线性关系(r=0.996);应用该方法测定了重组人奈西立肽、重组人表皮生长因子、虎纹镇痛肽、重组人心钠肽4种重组小分子多肽的相对分子质量,所测结果变异系数CV均小于3%。结论毛细管SDS无胶筛分电泳方便快速,灵敏度高,重现性好,结果准确,可作为小分子多肽相对分子质量的检测方法。     

流感疫苗血凝素含量测定替代方法的建立及验证

目的建立测定流感疫苗血凝素(Haemagglutinin,HA)含量的替代方法 ,并进行验证,以解决大流行流感发生初期疫苗原液中HA定量的难题。方法优化糖苷酶处理条件,将流感疫苗原液经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE方法分离样品,以灰度扫描法确定HA蛋白百分比,结合样品总蛋白数值,计算样品中HA含量。以该方法和传统的单向免疫扩散(SRID)法分别测定7批流感疫苗原液中HA含量,并进行比较。结果优化的糖苷酶处理条件为:总蛋白400μg/ml,PNGaseF加入比例为1:50。样品经糖苷酶处理后,以还原SDS-PAGE法可以清晰区分各蛋白条带,经测序后确定HA两个亚基,与预期相对分子质量一致。该方法测定7批流感疫苗原液中HA含量的结果与SRID法测定结果的符合率在87.90%~122.20%之间。结论初步建立了测定流感疫苗中HA含量的替代方法 ,在WHO参考品供应不到位时,可用于大流感发生时疫苗原液中HA之定量。     

剖宫产时蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因麻醉的ED50

目的:确定剖宫产时蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因(ropivacaine, Rop)麻醉的半数有效剂量(ED₅₀)。方法:32名ASA Ⅰ～Ⅱ 、择期在蛛网膜下隙-硬膜外隙联合麻醉(combined spinal-epidural anesthesia,CSEA)下剖宫产产妇参加试验。第一位产妇0.75% Rop 剂量为12.8 Mg, 以相邻剂量的98.4%为剂量的变化幅度。感觉、运动神经阻滞分别以针刺法及改良Bromage 法测定。麻醉有效的指标为:蛛网膜下隙给药后10 min 内感觉平面阻滞达到T₇、Bromage 达3分、切皮不痛、肌松满意。计算剖宫产时蛛网膜下隙0.75% Rop 麻醉的ED₅₀ 及其95%可信区间(CI)。结果:32名产妇中有5例麻醉效果可疑, 剔除出本研究。根据其余27名产妇序贯试验得出剖宫产时蛛网膜下隙0.75% Rop 麻醉的ED₅₀ 为11.97mg, ED₅₀ 的95%CI为11.75～12.19 mg 。结论:L3～4间隙CSEA 下剖宫产时, 蛛网膜下隙0.75%罗哌卡因麻醉的ED₅₀ 为11.97mg 。     

小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制

目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控。     

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种具有强烈溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶,近年来,国内外学者对其进行了广泛的研究。本文介绍了纳豆激酶的理化性质、主要生物学活性、溶栓机理及其生物学活性体外检测方法的研究进展。     

近年水痘减毒活疫苗批签发情况总结与质量分析

<正>水痘是由水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)引起的儿童期常见急性呼吸道传染病。水痘为该病毒原发感染的表现,主要侵染儿童,以皮肤和黏膜上出现疱疹为特征,症状较轻,但传染性强[1]。水痘减毒活疫苗是由VZV传代毒株制备而成,是预防VZV感染的最有效手段[2]。水痘疫苗的免疫持久性、普遍的耐受性和良好的安全性均已被广泛证实[3]。     

2011年流感疫苗批签发情况总结与质量分析

<正>流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道感染疾病。据统计,全球每年约有5%～15%的人口感染流感病毒,并导致300万～500万的严重病例和约50万的死亡病例。接种流感疫苗是预防流感发生与传播的有效手段。我国自2006年起对流感疫苗实行批签发。2011年,流感疫苗开始按《中国药典》三部(2010版)要求     

乙型流感病毒疫苗株全基因组序列测定及其在疫苗质量控制中的应用

目的建立乙型流感疫苗生产用毒株全基因组序列测定方法,将其应用于2013~2017年流感季节乙型流感疫苗生产用毒株的质量控制,为全面监测流感疫苗质量提供依据。方法利用通用引物对不同企业的乙型流感疫苗工作种子批进行一步法RT-PCR,以获得乙型流感病毒全基因组,DNA序列测定后,采用Clustal软件进行比对,在GISAID数据库中进行同源序列分析。结果不同企业间的Yamagata谱系工作种子批毒株序列一致,其中HA和NA基因均来源于B/Massachusetts/02/2012,PB2等其他内部基因来源不同;Victoria谱系工作种子批毒株的HA和NA基因与B/Brisbane/60/2008一致,但PB2等基因不同企业间存在差异。结论建立的一步法RT-PCR可用于乙型流感疫苗生产用毒株全基因组序列分析,可从源头保证流感疫苗的安全性、有效性以及疫苗质量的一致性。     

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准

目的　研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法 ,并制定其质量控制标准。方法　采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验 (KIRA ELISA) ,通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法 ,同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果　重组人纽兰格林刺激MCF 7细胞表面ErbB2 ErbB3分子磷酸化的反应存在量 效关系 ,相关系数大于 0 98,原液的平均比活性为 85 10U mg± 115 0U mg。并对原液设立肽图、纯度等检测项目 ,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论　KIRA ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性 ,结果准确可靠 ,重复性好 ;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。