一种新型的Tet-off慢病毒调控系统的构建及其调控作用

四环素调控的真核表达系统是真核细胞诱导表达系统的重要组成部分.当前大多数研究者采用双质粒四环素表达调控系统调控外源基因的表达.由于,双质粒四环素表达调控系统的基因表达调控严格依赖于两个单载体同时感染同一个细胞,因而限制其在体内实验中的效率.为解决该问题,研究构建了由慢病毒载体构成的单质粒四环素表达调控系统-pLV300(Tet-off).构建的载体经酶切鉴定及测序均正确.通过荧光观察及RT-PCR实验结果显示,该单质粒四环素调控的慢病毒载体体外可以高效地转移并且维持目的基因的表达,其表达调控效应高、无明显毒副作用,且调控严密.该表达调控系统为慢病毒的临床应用奠定了一定基础.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

突变型P53特异性活化T细胞的诱导与扩增

采用多种细胞因子诱导外周血单核细胞分化为成熟的树突状细胞（DC,Dentritic Cell）,将成熟DC与初始T细胞共培养,并连续加入DC刺激从而避免活化的T细胞凋亡。将活化的T细胞转入包被有CD3和CD28抗体的板中,使活化T细胞进一步大量扩增。流式检测多因子诱导后DC表型发现,高表达CD83、CD11c、CD11b、CD80、CD86、CCR7、CD54,低表达CD14、CD3、CD33,说明因子成功诱导单核细胞为成熟DC。流式检测扩增的活化T细胞发现高表达CD3、CD8,含有很低量的调节性T细胞（Treg）,分泌大量的IFN-γ,表明扩增出的细胞中活化T的含量很高,为临床研究提供参考。     

以干细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Hepa1—6重新编程的研究

利用逆转录病毒携带小鼠Oct4、Klf4、SOx2和c-Myc基因介导Hepa1-6小鼠肝癌细胞系重新编程,得到一团自律性跳动的细胞团,及一群形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代,克隆样细胞能保持其形态。检测证实,这些克隆样细胞团表达Oct4、Sox2蛋白。证实,Hepa1-6小鼠肝癌细胞可以被携带Oct4、KK4、SOX2和cMyc基因的逆转录病毒感染的方法诱导重新编程。     

增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24体外杀伤肝癌细胞的研究

研究溶瘤腺病毒SG511携带由热激蛋白70(hsp70)启动子调控IL-24构成的增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24对人肝癌细胞株的体外杀伤效果.实验采用ELISA法检测不同MOI值感染肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B细胞3 d后IL-24的表达;MTT法检测SG511、Ad11-IL24以及SG511-pHSP70-IL24对肝癌细胞株SMMC-7721、Hep3B以及人正常成纤维细胞株MRC-5及BJ增殖的抑制作用;并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况.ELISA检测到SG511-pHSP70-IL24感染SMMC-7721和Hep3B细胞后,IL-24有明显表达;MTT实验结果表明SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.同时结晶紫实验也证明了SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24相比腺病毒Ad11-IL24以及SG511,对肝癌细胞有较明显的生长抑制和凋亡诱导作用.     

奥沙利铂对结肠癌细胞株的体外作用研究

以结肠癌细胞株HT29和SW620为系统,研究奥沙利铂对结肠癌细胞株的体外增殖抑制作用及对细胞凋亡的影响.经奥沙利铂作用的细胞,通过MTT法测定细胞存活率、光学显微镜观察细胞形态变化、AO/EB染色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡等情况.结果表明奥沙利铂具有抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的活性.     

以干细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Hepa1-6重新编程的研究

利用逆转录病毒携带小鼠Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc基因介导Hepa1-6小鼠肝癌细胞系重新编程,得到一团自律性跳动的细胞团,及一群形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代,克隆样细胞能保持其形态。检测证实,这些克隆样细胞团表达Oct4、Sox2蛋白。证实,Hepa1-6小鼠肝癌细胞可以被携带Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc基因的逆转录病毒感染的方法诱导重新编程。     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链(50kD)和轻链(25kD);ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

贵州地区“紫红龙”火龙果采后病原菌分离鉴定

目的 分离鉴定贵州地区“紫红龙”火龙果在采后贮藏期间自然发病的病原菌。方法 “紫红龙”火龙果为试材, 通过涂布平板分离法以及划线纯化, 从贮藏期火龙果中分离、纯化采后病原菌, 并结合形态学观察与rDNA ITS (internal transcribed spacer)序列测定进行准确鉴定。结果 分离出1株真菌, 经鉴定该株病原菌为桃吉尔霉(Gilbertella persicaria)。结论 本研究在贵州地区腐烂的火龙果中首次分离得到G. persicaria, 该菌对红肉火龙果有较强的致病力。