携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体的构建

采用PCR扩增获得的pri-mir-20a,过渡质粒pcDNA3.0-H1经BamH Ⅰ与Hin dⅢ双酶切后将两者连接产生pcDNA3.0-H1-pri-mir-20a重组质粒,再将PCR获得的H1-pri-mir-20a克隆到慢病毒载体pdc-SEW上获得重组慢病毒载体pdcH1-pri-mir-20a-SEW.将pCMV 8.91、pMD2.VSV.G、pdcH1-pri-mir-20a-SEW三质粒共转染293FT细胞,结果显示48 h后绿色荧光蛋白的表达达到80%,表明已成功构建出携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体.该载体的成功构建为深入开展对miR-20a的生物学功能和靶标验证提供了有效的工具.     

昆虫杆状病毒表达egfp载体构建及鉴定

用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ将目的基因片段6His-11R-eGFP从载体pDC316-6His-11R-eGFP上酶切下来,并将该目的基因片段与供体载体pFastBacl连接构建供体质粒pFastBacl-6His-11R-eGFP;将其转化大肠杆菌(Escherichua coli)DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBac-6His-11R-eGFP,PCR鉴定得到单一目的基因条带.将该病毒载体转染Sf9细胞,进行病毒包装,在倒置荧光显微镜下观察蛋白表达,并以荧光定量PCR方法测定病毒滴度.     

AFP与CEA基因的启动子克隆及肿瘤细胞特异性表达的研究

为了研究AFP和CEA基因启动子的转录活性与肿瘤特异性,本实验利用PCR技术扩增AFP和CEA基因上游序列,并将其克隆到pGL3-Basic载体中构建pGL3-AFP和pGL3-CEA荧光报告质粒。将构建的pGL3-AFP和pGL3-CEA质粒分别与pRL-TK共转染人结肠癌细胞株SW620、肝癌细胞株Huh-7、肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela、人肝正常细胞株QSG-7701、人肺正常细胞株Beas-2b,用双荧光报告系统检测这两种质粒在不同细胞里的荧光活性表达。酶切和测序结果证实成功构建了双荧光素酶报告质粒pGL3-AFP和pGL3-CEA,双荧光素酶报告基因检测结果证明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性。这些结果表明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性,为进一步研究AFP和CEA基因的表达调控机制和探讨靶向基因-病毒治疗提供依据。     

AFP与OEA基因的启动子克隆及肿瘤细胞特异性表达的研究

为了研究AFP和CEA基因启：功子的转录活性与肿瘤特异性,本实验利用PCR技术扩增AFP和CEA基因上游序列,并将其克隆到pGL3-Basic载体中构建pGL3-AFP和pGL3-CEA荧光报告质粒。将构建的pGL3-AFP和pGL3-CEA质粒分别与pRL-TK共转染人结肠癌细胞株SW620、肝癌细胞株Huh-7、肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela、人肝正常细胞株QSG7701、人肺正常细胞株Beas-2b,用双荧光报告系统检测这两种质粒在不同细胞里的荧光活性表达。酶切和测序结果证实成功构建了双荧光素酶报告质粒pGL3-AFP和pGL3-CEA,双荧光素酶报告基因检测结果证明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性。这些结果表明AFP和CEA均具有一定的肿瘤特异性,为进一步研究AFP和CEA基因的表达调控机制和探讨靶向基因-病毒治疗提供依据。     

CDld基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体（带GFP荧光）中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201 转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础.     

E—cadherin启动子调控的慢病毒荧光报告载体的构建

E钙黏素（Dcadherin）的缺失是上皮一间质转化（EMT）的重要标志,而EMT可促进肿瘤细胞的侵润及转移。为进一步研究E-cadherin与EMT的关系,研究构建了N-cadherin启动予驱动的黄色荧光蛋白慢病毒表达载体,构建的载体经酶切鉴定正确;采用磷酸钙法包装出慢病毒,取病毒上清感染人肝癌PLC／PRF／5细胞株,通过荧光观察和qRT-PCR实验结果显示E-cadherin在靶细胞中稳定高表达。该载体的构建为深入研究E-cadherin相关的EMT现象提供了良好的工具。     

携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

HBV/HEV二价抗原的载体构建与表达

为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效重组原核表达载体,采用PCR方法扩增出HBV的S基因,及HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接、菌落PCR、双酶切、测序鉴定后,将这两部分重组入含有增强子的pT-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pT-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。该实验结果为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

高效表达Smad2蛋白的A549细胞模型的建立

将携带Smad2-Flag基因的慢病毒包装系列质粒转染293T细胞,进行慢病毒包装.用收集并纯化好的慢病毒感染A549细胞,流式分选筛选出GFP阳性的细胞,用Flag抗体和Smad2抗体进行Western blot鉴定.流式分选得到的GFP阳性的A549细胞经Western blot鉴定能高效表达外源Smad2-Flag融合蛋白,同时空载慢病毒处理的GFP阳性细胞并不表达Smad2-Flag蛋白.结果表明成功构建了高效表达Smad2蛋白的A549细胞系,为进一步研究超级干扰素抗肺癌的分子机制奠定了基础.