1 株产单宁酶嗜热真菌的鉴定、酶学性质分析及碳水化合物活性酶表达

对产单宁酶的1 株嗜热真菌HBHF5进行鉴定,开展单宁酶酶学性质的分析及碳水化合物活性酶（carbohydrate?active enzymes,CAZymes）的转录组学研究,探究嗜热真菌HBHF5在食品酶制剂开发中的潜力。经对菌株的菌落、孢子形态观察及ITS序列比对分析,最终鉴定嗜热真菌HBHF5为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。经分析,菌株HBHF5在固态发酵培养时不产单宁酶,而液态诱导培养时,菌株HBHF5胞内和胞外均检测到单宁酶活性,且以胞外酶为主（94%）,酶活力最高达136?U/mL。单宁酶最适反应温度为60?℃,在60?℃处理30?min,能够维持酶原活力的90%以上。该酶最适反应pH值为6.0,在pH?5.0～9.0范围内,能够维持60%以上的酶活力。不同金属离子对酶活力的影响存在差异,Cu2＋、Fe3＋、Mn2＋和Zn2＋对该单宁酶活性抑制较强。经转录组学分析,该菌以麸皮为唯一碳源时,共有淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等239?个CAZymes基因表达,其中糖苷水解酶类最为丰富,约占CAZymes表达总数的70%。A. fumigatus HBHF5是1 株优良产酶菌株,为具有食品酶制剂开发潜力的嗜热真菌。     

一株产谷氨酰胺转氨酶菌株的分离、鉴定及其tgl的克隆表达

用稀释平板法从土壤样品中分离到166株细菌菌株,通过凝胶法初筛和Folk比色法复筛,得到一株产谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)的菌株,通过形态学、生理生化特征和16S r DNA序列比对证明该菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为TGase1318。克隆了该菌株TGase的编码基因tgl,序列长738bp,编码由245个氨基酸组成的蛋白质;TGase的氨基酸序列与NCBI公布的B.subtilis的TGase相似性达94%~100%。用B.subtilis表达载体p TZ和E.coli表达载体p ET21b分别构建了含tgl的重组质粒,转化B.subtilis WB800和E.coli BL21,tgl基因表达产物在70℃下可催化BSA交联,表明tgl在B.subtilis和E.coli中获得了表达且表现出TGase活性,这为其在食品工业上的开发利用打下基础。     

1 株高产几丁质脱乙酰酶红球菌的基因组测序及其应用潜力分析

为高效利用虾蟹壳资源,推动壳聚糖的几丁质脱乙酰酶法生产,采用Illumina测序技术,对1 株高产几丁质脱乙酰酶的红球菌菌株11-3进行基因组测序,并进行系统的生物信息学分析,主要包括基因本体论（Gene Ontology,GO）、直系同源群集（Cluster of Orthologous Group,COG）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）功能注释,碳水化合物活性酶注释以及几丁质降解相关酶基因的生物信息学分析。研究发现,红球菌11-3的基因组为6 089 866 bp,共5 904 个编码基因,GC含量为70.514%。经碳水化合物活性酶注释共识别了165 个基因,包括59 个碳水化合物酯酶基因,42 个糖基转移酶基因,36 个糖苷水解酶基因和28 个辅助氧化还原酶基因,其中,鉴定出1 个几丁质脱乙酰酶基因（gene4907）,4 个几丁质酶（EC 3.2.1.14）基因（gene1286、gene1287、gene3810、gene4754）和2 个壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）基因（gene4921、gene5362）。gene4907与已报道的几丁质脱乙酰酶基因的序列一致性为26.60%～32.43%,为一种新的几丁质脱乙酰酶。因此,红球菌11-3菌株在几丁质资源的开发领域具有极大潜力。     

毕赤酵母单宁酶工程菌在固、液发酵中的性质差异分析

探究固、液发酵方式在重组毕赤酵母单宁酶工程菌的形态、产酶量及酶学特性等方面的差异。研究发现，重组菌株在固、液发酵方式下表现出了较大差异。固态发酵条件下，重组菌株能够积累更多的生物量，当培养48 h后积累的生物量比液态发酵高22.3%；经电镜分析发现，固态条件下，重组菌株个体之间更容易出现聚集，并伴随着有生物膜的产生；在不同甲醇体积分数诱导下，固、液发酵的重组菌株的产酶量均出现了先升高后降低的趋势，而诱导两者最高产酶量的甲醇体积分数却存在差异，分别是2%和3%。进一步研究发现，固、液发酵条件下，重组菌株发酵的单宁酶酶学性质也存在一定差异，固、液态发酵单宁酶的最适反应温度分别为30 ℃和为20 ℃，且酶的热稳定性也有一定提高，其余酶学性质差异不显著。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现，固态发酵生产的单宁酶存在不同的修饰，这可能是造成上述性质差异的原因之一。综上所述，本研究探究了固、液发酵条件下，重组单宁酶毕赤酵母菌株生长及产酶特性的差异，为高效制备单宁酶提供了一定的理论指导。     

甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性质差异分析及对多糖的协同降解

分析烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HBHF5来源的GH5家族甘露聚糖酶AfMan5A和微孢根霉（Rhizopus microsporus）GZHF10来源的GH134家族甘露聚糖酶RmMan134C的酶学性质差异,探究两者协同降解多糖的潜力。结果表明两者酶学性质差异较大,AfMan5A的最适温度和pH值分别为60 ℃和6.0,而RmMan134C最适温度和pH值为35 ℃和5.0。金属离子Cu2＋、Zn2＋和Mn2＋均表现出对2 个酶活性的抑制,而Mg2＋、Fe3＋和Li＋可促进AfMan5A活性,却对RmMan134C活性表现出轻微抑制。甘露聚糖酶RmMan134C较AfMan5A底物谱广,两者最适底物均为魔芋葡甘露聚糖。进一步研究发现,两者并未对甘露聚糖类底物表现出协同效果,而是在微晶纤维素的降解中表现出较好的协同作用,协同系数为6.1。本研究分析了GH5和GH134家族甘露聚糖酶的性质差异及降解多糖的协同效果,为甘露聚糖酶的进一步应用推广提供一定的理论支持。     

干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳工艺及其产品质量分析

针对目前益生菌发酵乳制品多为混合菌种发酵动物源乳制品的研究现状,本研究以燕麦为主要原料,通过制备纯燕麦乳,酶解,添加20%牛乳和7%蔗糖以及适量乳化剂与稳定剂,组成发酵培养基,以发酵乳制品中选育出的生长繁殖力强,发酵活力高的干酪乳杆菌05-20为试验菌株,研究接种量、发酵温度、发酵时间等单因素对干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳产品质量的影响。采用响应面试验优化干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳产品的工艺条件,分析干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳的产品质量,包括:感官、理化与营养成分、益生菌活菌含量与功能性成分、食品安全性、贮藏稳定性。结果表明:干酪乳杆菌纯种发酵燕麦乳的最适工艺条件为:接种量5.0%,发酵温度37℃,发酵时间5.3 h。该发酵乳呈微黄色,质地均匀细腻,酸甜可口,具有浓郁的燕麦香气和发酵香气,发酵乳活菌数达8.8×108 CFU/mL,滴定酸度49.05°T,蛋白质含量1.76 g/100 g,脂肪含量0.75 g/100 g,必需氨基酸含量占总氨基酸含量的55.92%,不饱和脂肪酸含量约占总脂肪酸含量的79.20%,燕麦β-葡聚糖的含量(92.00±1.29)μg/mL,总酚含量(13.00±0.38)μg/mL,抗消化物质质量分数(19.61±0.02)%,未检测出致病微生物和毒素,保质期为24 d。研究结果为工业化生产以植物蛋白燕麦为主的干酪乳杆菌纯种发酵乳制品提供了理论依据,也为新型益生菌发酵其它植物蛋白乳制品提供了新途径。     

基于原生质体法保加利亚乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对保加利亚乳杆菌原生质体法电转化效率的影响,通过研究电转化的最适条件,以提高电转化的效率。方法:以保加利亚乳杆菌为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究溶菌酶浓度、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成对电转化效率的影响。结果:用SMM在37℃下制备溶菌酶(30 mg/mL)对细胞进行酶解,直至通过显微镜发现约60%的原生质体形成。用1μL质量浓度为1.2μg/μL的质粒pMG36e,在电场强度7.5 kV/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并以含红霉素的MRS平板筛选,获得1.42×10~5CFU/μgDNA的电转化效率。结论:本研究实现了保加利亚乳杆菌的高效遗传转化,并为遗传育种提供了技术支持。     

鳐鱼硫酸软骨素提取工艺优化及其性质表征

以孔鳐加工的副产物软骨为原料,利用响应面方法优化鳐鱼硫酸软骨素提纯工艺,并对获得的鳐鱼硫酸软骨素进行质量及结构的表征。结果表明,最优提取工艺为碱液浓度2.3%、提取温度43℃、酶添加量0.7%时,硫酸软骨素提取率为43.32%。提取的鳐鱼硫酸软骨素符合国药标准,其重均分子量、数均分子量和多分散系数分别为40 752、38 257和1.065 2,经红外光谱分析,鳐鱼硫酸软骨素与鲨鱼硫酸软骨素具有相同结构组织,均由β-1,3糖苷键连接的β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖组成,该研究结果不仅可大幅度增加鳐鱼加工产业的附加值,也可为硫酸软骨素的工业生产提供一定的技术支持。     

甘露聚糖酶RmMan134B与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖

为挖掘新型GH134家族来源的甘露聚糖酶，评价其与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖的应用潜力，从小孢根霉GZHF10的基因组中成功获得1个新型GH134家族甘露聚糖酶（Rm Man134B），该基因编码181个氨基酸和1个终止密码子，经分析，与已报道的GH134家族活性基因的序列一致性较低（<69.6%）。采用大肠杆菌PET表达系统对该基因进行异源表达及性质测定，结果表明，该酶最适底物为魔芋甘露聚糖，最适温度和pH值分别为40℃和5.0。将魔芋粉在115℃和0.1 MPa的条件下进行非均相湿热处理，魔芋聚糖的结构和性质发生显著改变，其中处理2 h魔芋粉的溶液的表观黏度（30 g/L）降低96.1%，粉末粒径变小，热稳定性提高，改性魔芋粉的水解率提高0.6～1倍。进一步研究发现，Rm Man134B酶解产物的主要成分为单糖（0.922 mg/L）、二糖（1.4 mg/L）和三糖（0.613 mg/L）。本研究对魔芋甘露聚糖资源的高效利用和产业化发展具有一定的推动作用。     

四苯并卟啉锌及其衍生物敏化的TiO_2光催化降解曙红B的研究

为提高TiO2纳米晶在光催化过程中对可见光的利用效率,采用化学吸附的方法分别制备了四苯并卟啉锌、中位-四(酰氯基亚甲基)苯并卟啉锌和中位-四(羧基亚甲基)苯并卟啉锌修饰的TiO2纳米晶,并将其用于氙灯辐照下曙红B的降解。由于卟啉吸收可见光后,激发态电子能转移到TiO2的导带,敏化后TiO2的光降解效率均有所提高,其中中位-四(羧基亚甲基)苯并卟啉锌因其与TiO2有效地结合,降解效率最高。