介导纳豆激酶分泌表达的信号肽比较

以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的基因组为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽、成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-nk),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因(pro-nk),构建了含有三种不同信号肽的纳豆激酶重组质粒pMA0911-wapA-pro-nk、pMA0911-yncM-pro-nk、pMA0911-pre-pro-nk(m)。通过3种信号肽介导的纳豆激酶的分泌表达、酶活性质分析等实验结果表明,wapA信号肽介导的纳豆激酶的分泌效率以及纤溶酶活性最高。对wapA信号肽介导的纳豆激酶表达产物进行了纯化,纯化倍数及回收率分别为2.15和21.5%。酶学性质分析结果表明重组纳豆激酶的最适温度、最适pH分别为50℃和pH 8.0,纳豆激酶在温度低于60℃及pH 5.0~11.0比较稳定。本研究为纳豆激酶的基因工程改造以及进一步提高纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达量奠定了一定的基础。     

基于代谢工程策略合成L-苹果酸研究进展

L-苹果酸在食品、医药、化工等领域被广泛应用。工业上以石油基原料为底物,通过化学法或酶法合成L-苹果酸。随着石油资源的日渐短缺,利用可再生资源以生物法合成L-苹果酸受到人们的重视。近年来应用代谢工程策略改造大肠杆菌、酵母菌等菌株,进行L-苹果酸的合成,具有一定应用前景。同时,应用合成代谢工程在体外构建代谢途径进行L-苹果酸合成,具有较高的理论价值。本文首先总结了L-苹果酸合成的代谢途径;其次对L-苹果酸合成的代谢工程策略进行了综述,包括强化L-苹果酸合成代谢途径、删除副产物合成途径、促进还原力再生,以期较为系统地阐述L-苹果酸代谢机制的研究现状;最后对L-苹果酸代谢工程的研究方向进行了展望。     

粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。     

通过定点突变增强纳豆激酶的热稳定性

血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一,因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶因其特有的高效溶血栓作用,成为国内外科研热点之一。本研究针对目前纳豆激酶稳定性的问题,以纳豆激酶的晶体结构和序列比对为基础,通过定点突变构建组纳豆激酶突变体,对可能影响纳豆激酶热稳定性的氨基酸进行研究。在构建的5个突变体中,P14L、N76D两个突变体的热稳定性有明显提高,在65℃下的半衰期由20 min分别提高为30 min和50 min。同源建模和分子动力学研究结果表明,这两个氨基酸位点是通过不同机理对纳豆激酶催化活性以及热稳定性产生的重要作用。本研究可为纳豆激酶的基因工程改造以及其生产和应用提供理论基础和技术支持。     

[VEGF]hTERT复合调控序列介导HSV-tk自杀基因诱导肿瘤细胞的凋亡

目的构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)核心启动子及血管内皮生长因子(VEGF)增强子复合调控序列的真核表达载体,并检测在复合调控序列调控下HSV-tk自杀基因对肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法构建复合调控序列[VEGF]hTERT和胸苷激酶(tk)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和PCMV启动子的真核对照表达载体pcDNA3.1(+)-tk,转染肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选抗性克隆,给入前药丙氧鸟苷(GCV),MTT比色法测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果质粒pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和pcDNA3.1(+)-tk经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。转染了带有不同启动子的真核表达载体的肿瘤细胞,在给入前药GCV后均能表现出对细胞生长的抑制作用,GCV对A549细胞的抑制率大于SMMC-7721细胞,并能引起肿瘤细胞凋亡。[VEGF]hTERT在A549细胞中的活性较在SMMC-7721中高。结论HSV-tk自杀基因在肿瘤细胞内瞬时表达即能引起靶细胞凋亡,且复合调控序列在肿瘤细胞中的活性较通用真核细胞转录启动子PCMV高,为深入进行自杀基因治疗的研究提供了一定理论依据。     

搅拌桨组合数值模拟优化及在谷氨酰胺转胺酶发酵中的应用

搅拌是影响发酵过程的主要因素之一,组合不同类型搅拌桨、发挥其各自优势,势必能够优化搅拌性能、提高微生物发酵生产效率。本研究采用计算流体力学（CFD）方法,模拟六直叶涡轮桨（DT）和DT、DT和抛物线桨（BT6）、六斜叶桨（CM6）和DT以及CM6和BT6四种搅拌桨组合对流场和混合时间的影响。对模拟得到的混合时间进行实验验证。结果表明,最优组合为：上桨叶为CM6桨,下桨叶为BT6桨。吸水链霉菌WSH03-13产谷氨酰胺转胺酶（TG）的发酵实验结果表明：CM6和BT6桨组合可获得最高的谷氨酰胺转胺酶活性和生物量,分别为4.7U/mL和42.9g/L,较优化前（DT和DT桨）分别提高了53%和40.9%,说明优化后的搅拌桨组合更有利于微生物生长和发酵。研究结果为组合搅拌桨在微生物发酵过程中的应用提供了借鉴。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/(L·h)、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶两种同源异形体的鉴定及性质分析

目的探讨吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase,EC 2.3.2.13)的两种同源异形体成熟酶TGases A和TGases B的分子差异,并进行系统分析和鉴定。方法吸水链霉菌培养上清液经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化后,将纯化产物再经阴离子交换层析,分析纯化产物的分子表面带电性质,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和远紫外圆二色谱(far ultra-violet circular dichroism spectrometry,Far-UV CD)法分析纯化产物的肽段序列及二级结构的差异,并检测成熟酶N-末端氨基酸序列。结果经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化获得TGases的两种成熟酶TGases A和TGases B,均具有酶活性;TGase A和TGase B成熟酶分子具有不同的表面带电性质,酶活分别为(28.33±1.45)U/mg和(22.54±1.77)U/mg;TGases A和TGases B在质荷比(m/z)4 536.481和4 873.393处两个低丰度肽段有差异,但N-末端6个氨基酸序列完全相同;两者二级结构均以α-螺旋为主,但二级结构存在一定差异。结论吸水链霉菌TGases A和TGases B是由同一种酶原活化产生的同源异形体,两者的表面电荷性质、肽段序列及分子二级结构均有差异。     

利用同源片段交换提高腈水合酶的热稳定性

目的通过计算机辅助半理性设计对热不稳定的恶臭假单胞菌Psedomonas putida NRRL-18668腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)分子进行改造,提高酶催化的热稳定性和活性。方法以嗜热假诺卡菌Pseudonocardia thermophila JCM3095和睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosterone 5-MGAM-4DNHase作为模板,利用位点靶向氨基酸重组(site-targeted amino acid recombination,STAR)软件和分子动力学模拟分析选择合适的同源靶片段,通过同源交换替换Pseudomonas putida NRRL-18668NHase相应的片段,构建7株分别含有3种不同来源片段的新型杂合NHase,检测其热稳定性及活性;圆二色光谱分析野生酶和杂合酶3AB的二级结构。结果 7株杂合NHase(1A、2B、2C、2BC、3AB、3AC、3ABC)经50℃热处理10 min后,与野生型NHase相比,热稳定性分别提高了1.5~3.5倍,其中杂合NHase 3AB的热稳定性提高了3.5倍,酶活力提高了1.4倍;野生酶和杂合酶3AB二级结构中α螺旋含量分别为(34.56±3.21)%和(36.88±1.41)%,,β折叠含量分别为(19.78±3.21)%和(18.69±1.74)%。结论通过利用热稳定性的同源片段来替换相应的热不稳定结构域这种理性设计的方法,成功将不耐热的NHase改造成耐热杂合NHase,同时提高了酶的比活力,并能维持NHase分子的基本二级结构不改变。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/L h、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。