绿色木霉耐高温葡萄糖氧化酶的特性分析

从绿色木霉（Trichoderma viride）WX24菌株发酵中分离、纯化葡萄糖氧化酶（T. viride glucose oxidase,TvGOD）,研究其酶学特性,为葡萄糖氧化酶的应用提供理论基础。将绿色木霉胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析纯化,并研究酶学性质。由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得TvGOD表观分子质量93 kDa,达到电泳纯。经纯化,TvGOD比活力为426.67 U/mg,纯化倍数为14.36,活力回收率19.15%。TvGOD最适pH 6.0,最适反应温度60 ℃。70 ℃以下、pH 4～7之间,TvGOD稳定性好。所测金属离子中,Na＋和K＋对酶活力无影响,Fe2＋、Cu2＋和Zn2＋有轻微抑制作用,Mg2＋和Ca2＋对TvGOD有显著激活作用,而重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活力;丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟和金属螯合剂乙二胺四乙酸二钠对TvGOD抑制作用较为强烈;TvGOD对表面活性剂十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100和吐温80表现出强稳定性。以葡萄糖为底物,酶Km和Vmax分别为11.62 μmol/L和8.244 mmol/（L·min）。基于TvGOD在高温、酸性下的高活性与高稳定性以及对表面活性剂的高耐受性、对底物葡萄糖高亲和性等优良特性,TvGOD很有希望在面粉加工、食品饮料、饲料及生物传感器领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中应用。     

收益分享计划

阐述收益分享计划是一种管理体系,并非单纯是一种分配方法.介绍收益分享计划的产生与发展,并诠释其试用的范围与应注意的事项.     

用于高果糖浆制备的宛氏拟青霉嗜热嗜酸菊粉酶酶学特性分析

为实现酶法水解菊糖制备高果糖浆,从宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）XS27发酵液中分离纯化菊粉酶,并对其酶学特性进行研究。发酵液经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow层析、Sephacry S-100分子筛过滤层析,得到电泳纯的菊粉酶,比活力327.4 U/mg,纯化倍数37.85。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得菊粉酶为单一亚基的酶蛋白,分子质量62.0 kDa。菊粉酶能在较宽的pH值范围（3.5～6.5）内保持高活性,最适作用pH 4.0。在温度40～65 ℃之间,酶活力较高,最适作用温度为60 ℃。薄层色谱分析显示菊粉酶水解菊糖最终产物为果糖。以菊糖为底物,酶的Km和Vmax分别为5.93 μmol/L和75.18 μmol/（L·min）。Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋对酶有显著激活作用,Ba2＋、Ni2＋和Hg2＋对酶有一定抑制作用。β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸对酶有抑制作用,表面活性剂（十二烷基硫酸钠、Tween 80和Trition X100）以及乙醇对酶活力没有影响。从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化的菊粉酶在强酸高热的环境下具有强活性和稳定性,对表面活性剂乙醇有高耐受性,适合于果葡糖浆的工业化生产。     

深绿木霉嗜酸性阿魏酸酯酶酶学性质及生物质转化分析

为实现生物质的高效降解,制备具有重要生理功能的阿魏酸,本实验从深绿木霉XS6发酵液中分离纯化深绿木霉阿魏酸酯酶（Trichoderma atroatroviride feruloyl esterase,TaFAE）,并研究酶学特性。发酵液经(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Cellulose DE52阴离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析后,得到电泳纯的TaFAE,比活力134.3 U/mg,回收率28.9%,纯化倍数31.52。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得酶分子质量约为66.4 kDa。TaFAE对阿魏酸甲酯亲和力最高,以其为底物,酶Km值和Vmax值分别为0.53 mmol/L和16.74 μmol/（min·mg）。以芥子酸甲酯为底物,酶促反应速率最大,达到32.21 μmol/（min·mg）,是阿魏酸甲酯的2 倍,对咖啡酸甲酯无活性,说明该酶具有严格的底物特异性。TaFAE最适pH值和温度分别为pH 4.0和40 ℃。在pH 2.0～9.0的范围内,30～40 ℃温度下都表现出良好的稳定性。金属离子Ca2＋和Mg2＋对TaFAE活性有显著激活作用,重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活性;β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、十二烷基硫酸钠、Trition X-100增强酶活性,苯甲基磺酰氟有较强的抑制作用。木聚糖酶降解生物质的体系中加入TaFAE可显著增加阿魏酸和还原糖产量,表明TaFAE和木聚糖酶有良好协同作用。综上所述,TaFAE优良的耐酸性及其他酶学性质说明其在食品和饲料行业有较好的应用潜力。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca2+、Zn2+和Mg2+能够促进酶的活性,其中Ca2+激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。