坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/mL,最大酶反应速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。     

产黄青霉抗真菌几丁质酶的纯化及特性分析

为实现抗真菌性能的耐热新型几丁质酶在食品防腐及生物防治方面的应用，从产黄青霉Xch23中分离纯化几丁质酶（Chi-Pc76）并研究其应用特性。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76。最终得到Chi-Pc76纯化倍数17.1 倍，回收率21.6%，比活力为584.8 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Chi-Pc76分子质量61 kDa。纯化后的Chi-Pc76最佳反应条件为pH 6.0、温度55 ℃。Chi-Pc76在宽泛的pH 4.0～10.0之间稳定性强，其显著的热稳定性可达到70 ℃。Chi-Pc76对底物胶体几丁质具有高的底物特异性，对乙二醇几丁质、α-几丁质、β-几丁质有中等活性，而对其他受试底物无活性或痕量活性。以胶体几丁质为底物Km和Vmax值分别为0.25 mg/mL和20 μmol/（min·mg）。金属离子Ca2＋、Ba2＋、K＋、Na＋对酶有明显激活作用；十二烷基硫酸钠、吐温80、苯甲基磺酰氟和尿素对酶活力基本无影响，但Mn2＋、Co2＋、Fe2＋、Ag＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋、Hg2＋和β-巯基乙醇、二硫苏糖醇均对酶活力有抑制作用。Chi-Pc76对黑曲霉、黄曲霉、尖孢镰刀菌和橘青霉均有显著的抗真菌活性，对比文献为产黄青霉抗真菌几丁质酶。鉴于Chi-Pc76纯化简便、热稳定性好、宽广的pH值稳定性、高效降解几丁质和抗真菌等特点，产黄青霉Xch23几丁质酶在几丁质废料综合利用、生物转化药理活性产品、食品保鲜以及植物病原性真菌和昆虫幼虫生物防治等方面具有潜在价值。     

绿色木霉耐高温葡萄糖氧化酶的特性分析

从绿色木霉（Trichoderma viride）WX24菌株发酵中分离、纯化葡萄糖氧化酶（T. viride glucose oxidase,TvGOD）,研究其酶学特性,为葡萄糖氧化酶的应用提供理论基础。将绿色木霉胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析纯化,并研究酶学性质。由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得TvGOD表观分子质量93 kDa,达到电泳纯。经纯化,TvGOD比活力为426.67 U/mg,纯化倍数为14.36,活力回收率19.15%。TvGOD最适pH 6.0,最适反应温度60 ℃。70 ℃以下、pH 4～7之间,TvGOD稳定性好。所测金属离子中,Na＋和K＋对酶活力无影响,Fe2＋、Cu2＋和Zn2＋有轻微抑制作用,Mg2＋和Ca2＋对TvGOD有显著激活作用,而重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活力;丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟和金属螯合剂乙二胺四乙酸二钠对TvGOD抑制作用较为强烈;TvGOD对表面活性剂十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100和吐温80表现出强稳定性。以葡萄糖为底物,酶Km和Vmax分别为11.62 μmol/L和8.244 mmol/（L·min）。基于TvGOD在高温、酸性下的高活性与高稳定性以及对表面活性剂的高耐受性、对底物葡萄糖高亲和性等优良特性,TvGOD很有希望在面粉加工、食品饮料、饲料及生物传感器领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中应用。     

用于高果糖浆制备的宛氏拟青霉嗜热嗜酸菊粉酶酶学特性分析

为实现酶法水解菊糖制备高果糖浆,从宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）XS27发酵液中分离纯化菊粉酶,并对其酶学特性进行研究。发酵液经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow层析、Sephacry S-100分子筛过滤层析,得到电泳纯的菊粉酶,比活力327.4 U/mg,纯化倍数37.85。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得菊粉酶为单一亚基的酶蛋白,分子质量62.0 kDa。菊粉酶能在较宽的pH值范围（3.5～6.5）内保持高活性,最适作用pH 4.0。在温度40～65 ℃之间,酶活力较高,最适作用温度为60 ℃。薄层色谱分析显示菊粉酶水解菊糖最终产物为果糖。以菊糖为底物,酶的Km和Vmax分别为5.93 μmol/L和75.18 μmol/（L·min）。Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋对酶有显著激活作用,Ba2＋、Ni2＋和Hg2＋对酶有一定抑制作用。β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸对酶有抑制作用,表面活性剂（十二烷基硫酸钠、Tween 80和Trition X100）以及乙醇对酶活力没有影响。从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化的菊粉酶在强酸高热的环境下具有强活性和稳定性,对表面活性剂乙醇有高耐受性,适合于果葡糖浆的工业化生产。     

木聚糖酶活性测定的实践与研究

研究了木聚糖酶活性测定中的几个关键因素对酶活测定值的影响,并以此为主要依据,建立了应用DNS法测定木聚糖酶活力的方法:存50℃、pH6.50条件下,底物浓度1%,酶促反应时间10min,DNS显色5min,于波长540nm处测定吸光度值.以期建立木聚糖酶活性榆测的最佳条件,为进一步研究木聚糖酶纯化工艺提供相关的参考依据.     

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化,得到纯化152.54 倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE 检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS-PAGE 证明该酶的相对分子质量为64 000.该酶最适反应温度为55 ℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3～8之间都能够检测到酶活.以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06 μmol/L和38.91 μmol/(L·min);而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84 μmol/L和12.79 μmol/(L·min).     

黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效表达及其在果汁澄清中的应用

利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8?822.6?U/mL;经一步纯化后,该重组酶的比活力为8?522.7?U/mg,回收率为79.4%;该重组酶的最适反应pH值为5.0,在pH?3.0～6.5范围内40?℃保温2?h仍能保持50%以上的相对酶活力,在酸性pH值下稳定性良好;最适反应温度为50?℃,该重组酶在30～50?℃的范围内非常稳定;在1?mmol/L浓度下,Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Mn2＋、Ba2＋对该重组酶具有激活作用,其中Zn2＋、Ni2＋、Ba2＋激活作用较为显著,而十二烷基硫酸钠表现为抑制作用;底物特异性分析表明该酶能够特异性地降解高度甲酯化果胶,其对柑橘果胶（酯化度≥85%）酶活力高达31?248.0?U/mL;此外,重组酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁具有良好的澄清效果,其中橙汁的透光度提高了16.9?倍,苹果汁的透光度提高了10.5?倍,葡萄汁的透光度提高了4.7?倍。     

嗜热木聚糖酶的克隆表达及其在酶解生产低聚木糖中的应用

目的:为了获得一种耐高温的木聚糖酶,并对其生物特性进行表征,使其能够更有效地应用于低聚木糖的制备。方法:首先通过生物信息学分析,确定来自厌氧孢子菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903的木聚糖酶(CsXynB)基因序列,然后扩增CsXynB基因,以pET-20b为载体,构建重组质粒,将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,重组酶通过热处理和镍柱亲和层析纯化获得纯酶,将纯酶用于后续酶学性质和降解木聚糖的研究。结果:通过生物信息学方法研究表明,CsXynB属于糖苷水解酶第10家族。CsXynB的最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.5。在65℃以内,pH为5.5~7.5的条件下重组木聚糖酶的稳定性较高。以榉木木聚糖为底物时,CsXynB的K_m,V_max和K_cat值分别为1.8 mg/mL,46.0 U/mg和60.7 s-1。在65℃、pH6.5条件下,以榉木木聚糖为底物,木聚糖酶CsXynB反应1 h,生成的低聚木糖的主要成分为木二糖和木三糖。结论:CsXynB是一种极具特点的耐高温木聚糖酶,可以催化水解木聚糖生成高含量的木二糖和木三糖,在生产低聚木糖的应用中具有潜在价值。     

在黑果腺肋花楸中共发酵里氏木霉和绿色木霉生产木聚糖酶

木聚糖酶在造纸、酿酒等方面有广泛的应用。为了获得低成本高活力的木聚糖酶，以黑果腺肋花楸作为主要培养基原料，通过单因素试验和正交试验，探索里氏木霉和绿色木霉共发酵生产木聚糖酶的培养条件。结果表明，木聚糖酶活性最高的培养条件为氮源(NH₄NO₃)质量浓度0.5 g/L,果渣质量分数25%,里氏木霉与绿色木霉的质量比3∶2,接种质量分数14%,pH 5.50,培养到第4天时，其木聚糖酶活性高达121.62 U/mL。同时还探究了无机离子添加量对木聚糖酶活性的影响，无机离子的最佳添加量是MgSO₄ 12 mg/L和MnSO₄ 1.4 mg/L。结合正交试验的最佳培养条件以及最佳无机离子添加量进行发酵后，木聚糖酶的活性高达(127.25±0.09) U/mL,与基础培养基相比，木聚糖酶产量增加了69.46%。使用里氏木霉和绿色木霉共发酵黑果腺肋花楸生产木聚糖酶在获得了高活性木聚糖酶的同时降低了成本，对木聚糖酶工业化生产有重要参考价值。     

鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸盐缓冲液抽提,乙醇和硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乳酸脱氢酶。该酶经纯化后酶比活力达到668.82 U/mg,酶活回收率为25.79%,纯化倍数为185.78。该酶的全分子质量约为170.93 kD,亚基分子质量为44.72 kD;最适反应温度为45 ℃,最适pH值为7.4,在25～45 ℃及pH 5～10的范围内稳定性较好;在45 ℃、pH 7.4条件下,测得该酶对底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH）的Km值为3.407 μmol/L,对丙酮酸钠的Km值为8.431 μmol/L;草酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Co2＋、K＋对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用,而高浓度时具有抑制酶活性的作用。     

1株腈水合酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学特性

从济宁农田土壤分离筛选产生腈水合酶的菌株,利用薄层层析法(TLC)初步判断产酶能力,液体发酵复筛测定酶活力,筛选到酶活力达到3.6 U/mL的菌株Jn-102。通过菌体形态及菌落特征、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定菌株Jn-102为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。对其所产腈水合酶进行酶学性质分析,结果表明酶的最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,在40℃以下和pH6.0~8.0范围内酶活力较稳定,具有较宽的底物谱,对芳香腈有较好的水合作用,以对羟基苯乙腈为底物时K_m值和V_max值分别为21.3 mmol/L和60.2 μmol/(min·mg),Co2+和Mg2+等对酶活力有轻微的促进作用,而Zn2+对酶活力有强烈的抑制作用。阿氏芽孢杆菌Jn-102是1株腈水合酶活力较高的生产菌株,具有潜在的研究和应用价值。     

木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

研究了木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质。以缓冲液从木薯块根中获得粗提酶液,粗酶酶活力为9.37 U/g木薯干重;再分别通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.14 U/g木薯干重,经纯化β-葡萄糖苷酶纯度提高了14.62倍,总活力回收率为12.14%,电泳测得其分子量约70 kDa。该酶米氏常数K_m为3.60 mmol/L,V_max为12.36μmol/(min·mg protein);其最适pH为7.0,pH在6.0～8.0之间有较好的稳定性;在40℃以内有良好稳定性,在4℃存放30 d酶活力剩余81.78%。Mn²⁺和K⁺对酶有一定的促进作用,Al³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、尿素和SDS对酶没有显著影响(P>0.05),而Fe³⁺、F...     

裂褶菌极端嗜盐木聚糖酶ScXyn22的性质及对全麦面包品质的影响

研究裂褶菌（Schizophyllum commune）来源GH11家族木聚糖酶ScXyn22在毕赤酵母的表达,分析该酶的酶学性质及其对全麦面包品质的影响。ScXyn22的最适pH值和温度为4.5和55 ℃,为内切型木聚糖酶。ScXyn22水解桦木木聚糖比活力为（5 964.1±429.4）U/mg,Km为（3.25±0.27）mg/mL,Vmax为（1 288±9.14）μmol/（min·mg）。ScXyn22在含有1～5 mol/L NaCl反应体系中,水解桦木木聚糖的酶活力分别提高到1.64、2.13、2.31、2.39、2.3 倍;水解小麦阿拉伯木聚糖酶活力提高到1.21、1.46、1.58、1.48、1.16 倍;但对β-燕麦葡聚糖的水解活性降低19.31%、47.72%、55.97%、45.99%、38.18%。模拟人工肠液环境下,ScXyn22在20 min内的剩余酶活力为81%,在120 min后剩余酶活力65.77%。添加木聚糖酶对全麦面包的品质影响显著,当ScXyn22添加量为300 U/kg时全麦面包比容提高了19.7%;当添加量为150 U/kg时,面包硬度降低57.3%。该结果显示该木聚糖酶在全麦面包生产中具有很好的应用潜力。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

一种黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶克隆表达、性质分析和果汁澄清效果

利用基因重组技术克隆黑曲霉(Aspergillus niger)的1887 bp α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在毕赤酵母SMDl168中诱导表达获得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶.结果 表明,重组蛋白大小为85 kDa,纯化后其比活力为55.73 U/mg;最适反应温度和pH值分别为65℃和5.0;金属离子K+对该酶活力有...     

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶（命名为PulBa）分离纯化，研究其酶学特性，为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8，回收率53.2%，比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯，分子质量51.2 kDa。PulBa在45～70 ℃和pH 3～6范围内具有较高酶活力，最适反应温度55 ℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性，40～70 ℃孵育120 min保留最初活性的80%以上；pH 3～7范围内具有很高的稳定性，孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性，Mg2＋和Ca2＋能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖，对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性，但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的Km和Vmax值分别为1.34 mg/mL和24.6 μmol/（min·mg）。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明，PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键，产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶，该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性，在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。     

植物乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及其性质研究

经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤,由植物乳杆菌(LactobacillusplantarumL 2 9)分离纯化得到亚油酸异构酶,分子量为4 3ku。对其酶学性质进行研究,结果表明,温度37℃、pH 6 0时酶活性较高;Co2 + 、Fe2 + 可提高酶的活性,Cu2 + 、Zn2 + 则对酶活力有抑制作用;该酶作用于亚油酸的Km=2 5 3×10 -5mol/L ,Vmax=2 5 7×10 -8mol/ (min·mg)。