牙鲆淋巴囊肿病的PCR诊断方法研究

以中国养殖牙鲆 (Paralichthysolivaceus)淋巴囊肿病毒 (Lymphocystisdiseasevirus,LCDVcn)主要衣壳蛋白 (majorcapsidprotein ,MCP)基因的中间保守序列为目标基因 ,设计了一对特异性引物。该引物可扩增出 172bp的病毒DNA片段 ,其最小DNA检出量为 0 0 183ng。用PCR法从人工感染淋巴囊肿病毒 3天的牙鲆血、鳃、肝、脾、肠、胃及自然发病牙鲆的肿瘤中 ,分别检测到了LCDV的存在。本实验结果证明 ,PCR法对于早期检测LCDV是十分有效的。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

牙鲆淋巴囊肿病的诊断技术研究

使用本实验室设计的PCR引物，在标记反应体系下，通过PCR反应合成了碱基数为172bp的牙鲆（Paralichthys olivaceus）囊肿病（Lymphocysits disease,LCD）的地高辛标记探针，在其琼脂糖凝胶电泳图172bp处有明显的亮带，由软件分析得出，合成探针的浓度为500ng/μl，此结果证明，该产物确是所需的探针，且具有很好的合成效率。通过实验证明本文采用的核酸探针-杂交诊断方法可以有效地定性和定位LCDV。实验结果还提示。LCDV是通过血液在牙鲆体内传播的，并可能同时存在垂直和水平两种传播方式。     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备

用本实验室分离纯化的淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China,LCDVcn)作为抗原,感染BALB／c小鼠,取被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0融合;ELISA法检测、筛选阳性克隆,经过3次克隆化,首次成功获得18株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。     

栉孔扇贝种群的遗传变异分析

采用不连续聚烯酰胺凝胶电泳技术研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个天然种群的六种同工酶。结果表明,两个种群具有基本相同的基因位点控制同工酶的表达,二者都具有居群内的个体差异,中国和日本的两个种群的多态位点比例（P．99）分别为41．18％和45．45％,平均杂合度观测值（Ho)分别为0．1295和0．1531,平均杂合度预期值（He)分别为0．1695和0．2331,各位点平均等位基因数（Ne)分别为1．5294和1．6363。日本栉孔扇贝自然种群的遗传变异明显高于中国栉孔扇贝自然种群。同时各群体中普遍存在杂合子缺失现象。     

军曹鱼淋巴囊肿病毒的系统关系研究及基因型分析

从患淋巴囊肿病的养殖军曹鱼肿瘤中分离到一种虹彩病毒,命名为淋巴囊肿病毒军曹鱼分离株(LCDV-rc).为探讨LCDV-rc的系统地位,从DNA水平上分析了该病毒株与淋巴囊肿病毒中国牙鲆分离株(LCDV-cn)、淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株(LCDV-sb)、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株(LCDV-jf)、淋巴囊肿病毒欧洲分离株(LCDV-1)和淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株(LCDV-rf)的系统关系.以核衣壳蛋白(MCP)基因为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356bp的含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验.结果表明,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构一致,LCDV-rc和LCDV-sb聚为一支,LCDV-cn和LCDV-jf聚为一支,LCDV-1和LCDV-rf分别各为一支.在35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-rc与另5株淋巴囊肿病毒在系统树上聚为一大支,说明LCDV-rc与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒.根据遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-rc属于一种新的基因型,称其为淋巴囊肿病毒Ⅳ型基因型.     

牙鲆抗淋巴囊肿病毒免疫球蛋白的纯化

采用饱和硫酸铵沉淀、DEAE 52纤维素离子交换柱层析和Sepharose 6B凝胶过滤的方法 ,首次得到了纯化的牙鲆抗淋巴囊肿病毒IgM。该IgM的重链与轻链分子量分别为 74KD和 2 2KD。     

牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系FG-9307中的增殖

向已建立的牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞系^[1](FG-9307)中接种淋巴囊肿病（Lymphocystis disease virus,LCDV）、探讨其是否可支持LCDV的增殖。光学显微镜观察发现：接种3天后，呈纤维状的鳃细胞隆起、立体感加强；之后细胞逐渐变圆，一周左右绝大部分鳃细胞变圆、呈现了细胞病变（cytopathic effect,CPE）现象。将CPE细胞制作超薄切片，电镜观察发现细胞内有大量具囊膜、直径133－186nm的LCDV。CPE细胞的核变形、线粒体增加且空洞化，出现了与淋巴囊肿细胞相同的特征。本实验证明：FG－9307是可持续LCDV增殖的鱼类细胞系。     

栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的FCM法检测

建立了热激、冷激、细菌感染和水质恶化等逆境中栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的流式细胞术检测法。结果发现,该方法可灵敏检出上述条件下,血淋巴细胞中HSP70表达的增加。Duncan检验显示,热激条件下HSP70表达增加最为显著。