牙鲆淋巴囊肿病的诊断技术研究

使用本实验室设计的PCR引物，在标记反应体系下，通过PCR反应合成了碱基数为172bp的牙鲆（Paralichthys olivaceus）囊肿病（Lymphocysits disease,LCD）的地高辛标记探针，在其琼脂糖凝胶电泳图172bp处有明显的亮带，由软件分析得出，合成探针的浓度为500ng/μl，此结果证明，该产物确是所需的探针，且具有很好的合成效率。通过实验证明本文采用的核酸探针-杂交诊断方法可以有效地定性和定位LCDV。实验结果还提示。LCDV是通过血液在牙鲆体内传播的，并可能同时存在垂直和水平两种传播方式。     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备

用本实验室分离纯化的淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China,LCDVcn)作为抗原,感染BALB／c小鼠,取被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0融合;ELISA法检测、筛选阳性克隆,经过3次克隆化,首次成功获得18株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

军曹鱼淋巴囊肿病毒的系统关系研究及基因型分析

从患淋巴囊肿病的养殖军曹鱼肿瘤中分离到一种虹彩病毒,命名为淋巴囊肿病毒军曹鱼分离株(LCDV-rc).为探讨LCDV-rc的系统地位,从DNA水平上分析了该病毒株与淋巴囊肿病毒中国牙鲆分离株(LCDV-cn)、淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株(LCDV-sb)、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株(LCDV-jf)、淋巴囊肿病毒欧洲分离株(LCDV-1)和淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株(LCDV-rf)的系统关系.以核衣壳蛋白(MCP)基因为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356bp的含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验.结果表明,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构一致,LCDV-rc和LCDV-sb聚为一支,LCDV-cn和LCDV-jf聚为一支,LCDV-1和LCDV-rf分别各为一支.在35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-rc与另5株淋巴囊肿病毒在系统树上聚为一大支,说明LCDV-rc与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒.根据遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-rc属于一种新的基因型,称其为淋巴囊肿病毒Ⅳ型基因型.     

牙鲆淋巴囊肿病毒在牙鲆鳃细胞系FG-9307中的增殖

向已建立的牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞系^[1](FG-9307)中接种淋巴囊肿病（Lymphocystis disease virus,LCDV）、探讨其是否可支持LCDV的增殖。光学显微镜观察发现：接种3天后，呈纤维状的鳃细胞隆起、立体感加强；之后细胞逐渐变圆，一周左右绝大部分鳃细胞变圆、呈现了细胞病变（cytopathic effect,CPE）现象。将CPE细胞制作超薄切片，电镜观察发现细胞内有大量具囊膜、直径133－186nm的LCDV。CPE细胞的核变形、线粒体增加且空洞化，出现了与淋巴囊肿细胞相同的特征。本实验证明：FG－9307是可持续LCDV增殖的鱼类细胞系。     

栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的FCM法检测

建立了热激、冷激、细菌感染和水质恶化等逆境中栉孔扇贝血淋巴细胞HSP70表达变化的流式细胞术检测法。结果发现,该方法可灵敏检出上述条件下,血淋巴细胞中HSP70表达的增加。Duncan检验显示,热激条件下HSP70表达增加最为显著。     

海洋抗菌肽研究进展

抗菌肽是基因编码的肽类抗菌分子,广泛分布于整个生物界,是脊椎动物、无脊椎动物和植物先天免疫的关键因子。本文综述了目前已发现的海洋动物抗菌肽的种类、结构、功能及分子生物学等研究状况,探讨了其在免疫防御中的作用及其应用前景。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

分子标记技术的进展及其应用

综述了分子标记产生与发展的过程,综合比较,分析了目前常用的RAPD、DAF、SSCP、AFLP、VNTR、RFLP、同工酶等分子标记技术的原理、特点和适用范围,简要介绍了分子标记技术的研究与开发现状以及未来的发展趋势。