中试规模制备L-茶氨酸及其衍生物

报道了中试规模制备L-茶氨酸和L-谷氨酰胺的一种方法。以廉价的L-谷氨酸为原料,采用邻苯二甲酰基作为保护基,保护L-谷氨酸的α-氨基,醋酐回流10 m in使其分子内脱水生成N-邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐,在常温、常压条件下,分别与2 mol/L氨水和2 mol/L乙胺水溶液反应生成中间产物N-邻苯二甲酰-L-谷氨酰胺、N-邻苯二甲酰-L-茶氨酸,中间产物在室温条件下与0.5 mol/L水合肼反应48 h脱除保护基,分别以57%、61%的收率得到L-谷氨酰胺和L-茶氨酸。     

色氨酸酶重组基因表达及其酶法合成L-色氨酸

为实现色氨酸酶高效、低成本催化合成L-色氨酸,利用p ET30a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的色氨酸酶,以丙酮酸、吲哚和氨为底物,探究其酶学性质,考察了反应温度、起始p H、底物摩尔比对酶促反应的影响,并利用丙酮酸发酵液为底物酶法合成L-色氨酸。结果表明,色氨酸酶重组表达成功,色氨酸酶最佳反应条件为:温度35℃,起始p H=9.0,底物摩尔比n(吲哚)∶n(丙酮酸)=0.6∶1,底物丙酮酸浓度为0.17 mol/L。利用重组色氨酸酶全细胞催化100 m L浓度为0.57 mol/L丙酮酸发酵液,流加浓度为4.27 mol/L吲哚酒精溶液6.5 m L,反应28 h后,L-色氨酸浓度达0.25 mol/L,吲哚摩尔转化率达91.8%。     

酶法转化制备L-瓜氨酸

利用粪链球菌精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸制备L-瓜氨酸。考察了菌龄、转化温度等多种因素对精氨酸脱亚胺酶活力的影响。酶法制备L-瓜氨酸的最适工艺条件是:菌体发酵时间20 h,转化温度37℃,转化液起始pH为6.0,ρ〔十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)〕=0.3 g/L使酶活提高了414%。c(Co2+)=10-3mol/L使酶活增高约50%,c(Cu2+)=10-2mol/L或c(Zn2+)=10-2mol/L使酶活下降约50%。Ca2+、Mg2+和Mn2+对酶活影响较小。     

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。     

米曲霉氨基酰化酶拆分DL茶氨酸

DL-茶氨酸经乙酰化可生成N-乙酰-DL-茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分N-乙酰-DL-茶氨酸可以获得L-茶氨酸。本文对氨基酰化酶酶促反应也进行了初步研究，考察了反应温度、反应时间、pH值和底物浓度等因素对酶促反应的影响。实验表明，转化温度40℃、转化时间30h、pH为7．0和底物浓度0．2mol／L时，目的产物L-茶氨酸的产率最高。     

双酶连续催化生物合成D-丙氨酸

建立了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶双酶连续催化制备D-丙氨酸的方法。利用天冬氨酸消旋酶全细胞催化L-天冬氨酸消旋得到DL-天冬氨酸,离心去除天冬氨酸消旋酶全细胞后升温灭活残留的游离天冬氨酸消旋酶,再加入经镍柱亲和纯化的D-氨基酸转氨酶酶液,催化D-天冬氨酸(D-Asp)和丙酮酸(PA)经转氨反应生成D-丙氨酸。经单因素实验得到天冬氨酸消旋酶最佳催化条件为:反应温度40℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH=7.0),底物L-天冬氨酸质量浓度为100 g/L。D-氨基酸转氨酶最佳催化条件为:反应温度42℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0),4 mmol/L磷酸吡哆醛,DL-天冬氨酸质量浓度为50 g/L,底物n(PA)∶n(D-Asp)=1∶10。转化产物经等电点结晶和阳离子树脂分离得到D-丙氨酸。在该条件下,D-天冬氨酸转化率达94%,D-丙氨酸收率为84%,对映体过量值(ee值)=98%。     

反胶束萃取精氨酸脱亚胺酶

报道了用反胶束体系萃取精氨酸脱亚胺酶(ADI)的研究结果,为精氨酸脱亚胺酶的分离纯化提供了一种方法。在反胶束体系中采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂,正辛烷和丁醇作为溶剂及助溶剂。考察了水相pH、振荡时间、离子强度、表面活性剂浓度及精氨酸脱亚胺酶质量浓度等因素对精氨酸脱亚胺酶分离纯化效果的影响。实验结果表明,当c(CTAB)=0.01 mol/L,pH=7,振荡时间15 min,体系中用于反萃取的c(NaCl)=0.75 mol/L,且起始粗酶质量浓度控制在30 g/L时,通过辛烷/丁醇/CTAB反胶束体系的萃取和反萃取,ADI酶液萃取率E达到85%,比活达到1.107 U/mg,是起始酶液的4.52倍。     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞催化合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶(TPL),以丙酮酸和L-丝氨酸为底物全细胞催化合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH=8.0,4mmol/L PLP,氯化铵浓度350 mmol/L。1 mmol/L triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子对TPL酶活都有明显的抑制作用。0.1 mol/L丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

酶法制备D-谷氨酸和γ-氨基丁酸的工艺研究

考察了大肠杆菌AS1．505的L-谷氨酸脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,分析了转化体系温度、pH值等因素对L-谷氨酸脱羧酶活力的影响。实验结果表明最佳工艺为：温度37℃,转化体系pH值4．8,茵体浓度6g／L,吐温-800．15g／l,菌龄14h,底物浓度50g／L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到15036U。1g湿菌体可重复使用3次共转化DL-谷氨酸25g,其中L-谷氨酸可以完全转化为γ-氨基丁酸。D-谷氨酸及γ-氨基丁酸的总收率可以分别达到理论收率的87％和85％。     

酶法分离制备γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸

以L-谷氨酸(L-G lu)和L-天冬氨酸(L-Asp)两种混合酸性氨基酸〔m(L-G lu)∶m(L-Asp)=1∶1〕为原料,利用大肠杆菌菌体内脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,酶法分离制备了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。考察了转化体系温度、pH等影响L-谷氨酸脱羧酶活力的主要因素,实验表明,最佳工艺条件为:温度35℃,转化体系pH=5.0,ρ(菌体)=6 g/L,ρ(Tween80)=0.15 g/L,菌龄16 h,ρ(底物)=60 g/L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活高达15 036 U。1 g湿菌体可重复使用3次共转化L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物30 g,其中L-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸的总收率可分别达到理论收率的88%和90%。