外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

豆豉纤溶酶液体发酵生产条件的研究

研究了芽孢杆菌菌株WMIl发酵生产豆豉纤溶酶的条件．结果表明,最佳发酵条件为：氮源w（带鱼蛋白胨）=3％,w（酵母膏）=0．5％;碳源w（水溶性淀粉）=3％;无机盐的用量为w（K2HPO4）=0．6％,w（KH2PO4）=0．1％,w（MgSO4）=0．1％,w（CaCl2）=0．04％,c（MnCl2）=10^-4mol／L;w（青霉素）=0．01％;培养基pH=6．0,培养温度为37℃．在此条件下,纤溶酶活性可达2345IU／mL．     

分子伴侣共表达对核糖核酸酶R可溶性表达的影响

核糖核酸外切酶R(RNase R)可降解几乎所有的线性RNA分子和Y结构RNA,但不易降解环形RNA(circ RNA)、套索结构(lariatRNA)和3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子,因此可以构建内含子c DNA文库用于可变剪切研究。本研究构建了含rnr基因的重组表达质粒pET-22b(+)-rnr,并将其表达产物纯化后通过SDS-PAGE分析和酶活性评价,确认rnr基因在大肠杆菌中已实现表达。之后构建4种分子伴侣共表达系统(pGro7、pKJE7、pTf16和pG-Tf2)。4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET-22b(+)-rnr共表达,筛选最适分子伴侣质粒,并优化共表达条件,提高目的蛋白可溶性表达。实验表明,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了43.80%,效果最为显著;20℃诱导时目的蛋白的可溶性表达最高;当L-阿拉伯糖浓度为0.50 mg/mL时,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了54.50%。通过使用分子伴侣共表达系统及优化表达条件提高了RNase R的可溶性表达,为该酶进一步研究奠定了基础。     

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选

米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase,RML）在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列：FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子（α-mating factor,α-MF）信号肽为对照,考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPinkTM表达系统的分泌效果。结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF,分别是α-MF的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍;FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍,说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。     

黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B催化仲醇动力学拆分

光学活性仲醇是合成多种生物活性化合物的原料和关键中间体,微生物细胞表面展示酶在生物催化和生物转化制备生化产品等方面表现出良好的应用性。研究了黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)制备的全细胞催化剂(AN-CALB)动力学拆分仲醇的催化性能。以2-辛醇作为反应底物,研究了酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比、AN-CALB添加量、水活度、温度及溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响,确定最优反应条件为:以乙酸异丙烯酯为酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比1∶1、AN-CALB添加量50 g·L-1、水活度0.11、温度45℃、以甲苯为溶剂,在此条件下,反应12 h的底物转化率达47.4%,eep值为99.6%,E值大于600。在最优反应条件下,AN-CALB对8种仲醇均表现出较好的拆分效果,底物转化率最高接近50%。该研究为仲醇动力学拆分提供了新的催化剂选择。     

重组脂肪酶全细胞催化单糖酯的合成

利用毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipaseB,CALB)为全细胞催化剂,以不同单糖(葡萄糖、果糖和甘露糖)为酰基受体,不同脂肪酸(月桂酸、油酸和棕榈酸)为酰基供体,在以不同有机溶剂为介质的非水相体系中催化合成糖酯.探讨全细胞脂肪酶CALB合成糖酯的反应条件,结果表明:毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂在叔戊醇/二甲基亚砜(4:1,v/v)介质中可以有效的合成糖酯,研究中各种酰基受体和酰基供体在全细胞脂肪酶催化下均能合成糖酯,其中果糖作为酰基受体产物浓度最高.     

CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

利用酿酒酵母为宿主,以果糖为原料合成D-阿洛酮糖具有食品方面的先天优势。为了减少酿酒酵母宿主本身对果糖的消耗,对酿酒酵母的己糖激酶同工酶2(Hexokinaseisoenzyme2,hxk2)基因进行编辑。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建了Cas9和gRNA共表达质粒p YES2-CG-Δhxk2,以酿酒酵母BY4741为出发菌株,URA3为筛选标记,采用高效电击转化法和胞内同源重组技术,获得hxk2基因缺陷株BY4741-Δhxk2。在此基础上,进行果糖发酵实验以评估突变菌株的果糖消耗速率。实验结果显示,发酵培养14 h时,缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率为3.35 mg/h;与野生型菌株相比其下降了6.42%。此外,发酵培养22 h,BY4741-Δhxk2的OD600nm值为8.65,相比于野生型提高了6.40%。研究表明,己糖激酶hxk2基因的缺陷编辑可以一定程度降低酿酒酵母对果糖的利用,同时缺陷株较野生型表现出一定的生长优势,这为后续以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛酮糖奠定了初步基础。     

酶法催化生产1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中甘油三酯的重要组成成分,可有效改善和保证棕榈酸在婴幼儿体内的吸收和利用。本文对其脂肪酶催化生产进行了简单探索,以三棕榈酸甘油酯(PPP)和油酸(OA)为底物,通过1,3-特异性脂肪酶RMIM催化的酸解反应成功制备了1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。经单因素优化后最佳反应条件为:PPP与油酸摩尔比1:6,加酶量8%,反应温度50℃,反应时间6 h,反应产物中脂肪酸组成为:油酸54.86%,sn-2位棕榈酸含量为87.64%。     

类芽孢杆菌碱性果胶裂解酶Pel在毕赤酵母中的高效表达

本研究全基因合成了来源于类芽孢杆菌的碱性果胶酶基因pel,克隆至p HKA载体上,成功实现其在毕赤酵母GS115中的分泌表达;并对信号肽和启动子进行优化,使得摇瓶发酵诱导168 h果胶裂解酶酶活达到432.36 U/m L。初步测定了果胶裂解酶Pel的基本酶学性质,其最适反应温度和p H分别为60℃、10.0;在50℃下处理300 min裂解酶活力保留90%以上,而在60℃下处理210 min,酶活力剩余约50%;在p H 9~12的50 m M各缓冲液中处理酶液16 h,酶活力仍然保留90%以上,该酶耐碱性强,但在偏酸性缓冲液中处理该酶,酶活力有所下降;同时研究了二价金属离子对果胶裂解酶活性力的影响,Ca~(2+)对Pel发挥裂解作用是必需的,Fe~(2+)、Mg~(2+)、Ni~(2+)对Pel均有激活作用,而金属离子螯合物EDTA的存在则使酶活力完全丧失;该酶在碱性条件下较好的稳定性决定了其潜在的工业应用前景。     

酶在废纸脱墨方面的应用现状

综述了生物酶法脱墨的机理、工艺及应用,分析了其优点和不足,并展望了其发展前景。