从烟草悬浮细胞中分离液泡前体的方法研究

通过跟踪含有液泡前体特异标记物的组分, 利用细胞壁酶水解胞壁制造原生质体, 并用真针头挤压的方法裂解细胞, 用蔗糖密度梯度离心的方法分离液泡前体. 通过相差显微镜观察, 发现所分离的液泡前体保持完整的结构. 利用不同细胞器的标记物抗体进行免疫标记检测, 证明所纯化的液泡前体不含其他细胞器, 具有较高的纯度.     

烟草液泡前体的分离与超微结构研究

从含有液泡前体荧光标记物的烟草转基因细胞系中分离纯化液泡前体.用荧光共聚焦显微镜跟踪观察纯化过程,明显观察到荧光信号的逐渐增强.纯化后的组分经负染后直接用电子显微镜观察,可见大小形态均一的细胞器,经脱水包埋超薄切片处理后在电子显微镜下可见多小泡体结构的细胞器,该细胞器可被液泡前体的特异标记物VSR标记.荧光信号的逐渐增强和液泡前体特异标记物的标记结果证明,所分离得到的多小泡体是液泡前体.     

储存mRNA在大豆胚根萌发过程的作用

为研究种子是否能完全依靠储存的mRNA或储存的蛋白质完成萌发过程,分别利用转录抑制剂α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)和制剂放线菌酮处理大豆胚根,抑制新的mRNA或新的蛋白质的合成,观察大豆胚根的萌发情况.结果发现,在转录抑制的条件下,大豆胚根能够完成萌发,种子萌发后,种苗生长停止;在翻译被抑制的条件下,大豆胚根不能完成萌发.说明大豆胚根萌发能够依赖发育过程合成并贮存在干种子中的mRNA;但种苗的发育不能完全依赖储存的RNA,需要新合成的mRNA参与.大豆胚根不能依赖储存蛋白质完成萌发过程.对大豆胚根细胞内容物进行超速离心并对不同组分中mRNA含量进行定量分析发现,干种子中的mRNA主要存在于多核糖体之外的细胞结构中,而在萌发过程中,mRNA主要存在于多核糖体中.这表明干种子中的mRNA主要以储存状态存在于mRNA的储存结构中,萌发过程大部分mRNA从储存结构中转移到多核糖体中变为活跃的翻译状态.不同萌发时期多核糖体的特征曲线也体现mRNA在细胞内存在位置的这种变化.     

细胞质处理小体(P-小体)与基因表达的调控

m RNA处理小体,又称P-小体(processing bodies,P-bodies),是细胞质中含有多种功能蛋白和RNA的聚集体.评述P-小体的形成和运动特点,以及其与小RNA、外切体相互作用,参与基因表达的调控.介绍了本实验室在P-小体植物细胞中的最新研究进展.指出P-小体是m RNA降解和储存的场所,在转录后水平参与基因表达的调控,P-小体在细胞中是动态变化的,P-小体中多样化的功能蛋白在P-小体的组装、功能行使中发挥重要作用.P-小体作为细胞质内m RNA的储存和降解结构在基因表达的转录后调控中起重要作用,其调控机制尚待进一步研究补充,P-小体与小RNA分子(micro RNA,mi RNA)调控的基因沉默之间也存在关联性.     

RNA在植物细胞中的定位及其研究进展

评述RNA在植物系统中的亚细胞定位、定位机制及活细胞中RNA成像的最新研究成果.指出RNA在细胞质内存在多处不同位点,且因存在多种不同的RNA定位途径将RNA运送并释放到特异位点.RNA的亚细胞定位与蛋白质定位、RNA存在状态、极性细胞的生长及RNA在细胞中的功能密切相关,该定位过程对植物建立和维持细胞极性生长有重要意义.目前RNA成像技术的不断更新,表现在利用基因工程技术构建RNA报告分子,直接标记RNA等方法的成功应用,对植物细胞中RNA的定位及其机制研究有很大的推进作用.     

甘露糖外切酶的细胞生物学定位研究

用不同试剂从西红柿种子提取甘露聚糖外切酶, 结果表明甘露聚糖外切酶只能被含高盐的缓冲液 （0.1mol/L Hepes ＋ 500 mmol/L NaCl, pH 7.0）提取出来,单独的低盐缓冲液 （0.1 mol/L Hepes, pH 7.0）或用非盐洗涤剂代替高盐则不能提取该酶.通过基因枪将甘露聚糖外切酶和GFP融合蛋白转化洋葱表皮细胞,发现转化了甘露聚糖外切酶和GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞壁上有荧光,表明甘露聚糖外切酶可能定位在细胞壁上.     

逆境诱导烟草悬浮细胞内处理小体的形成

指出处理小体( processing body,P-body)在真核细胞基因表达调节过程中,特别是在逆境条件下,能为mRNA在细胞质内转运提供储存和降解场所.研究通过农杆菌转化法成功将含有处理小体荧光标记物-脱帽酶1( decapping enzyme,DCP1)与青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)融合蛋白基因的植物表达载体转入烟草悬浮细胞.利用激光共聚焦显微镜观察到在高温和盐胁迫下,处理小体的数量和体积都有增加.通过蔗糖密度梯度离心分析逆境条件下多核糖体的变化,发现在高温和盐胁迫下,多核糖体解体,呈现翻译抑制特征.     

核苷酸转移酶与玉米非生物胁迫响应

核苷酸转移酶(nucleotidyl transferase protein,NTP)能够对RNA 3'末端进行修饰,从而影响其稳定性.通过分析玉米NTP蛋白家族的结构域与拟南芥、水稻中NTP蛋白进化的关系,发现玉米中含有24种NTP基因,并且玉米、拟南芥和水稻3种植物中的NTP基因具有高度同源性与保守性.对玉米NTP基因启动子上游顺式作用元件进行预测分析,结果显示,玉米NTP基因启动子中含有多个与非生物胁迫相关的启动子元件.通过反转录聚合酶链式反应分析在高盐、干旱、植物激素脱落酸的非生物胁迫条件下,玉米NTP相关基因的表达量,研究发现,玉米NTP基因能被非生物胁迫诱导表达.实验表明玉米NTP基因与非生物胁迫相关,且可能参与了植株抵抗逆境胁迫的过程.