聚乙二醇化重组人生长激素的性质及活性

目的　研究聚乙二醇化重组人生长激素的性质及活性。方法　通过分子筛高效液相 (SizeexclusionHPLC)、毛细管等电聚焦 (CIEF)、圆二色谱 (CD)以及荧光光谱等方法检测单聚PEG- GH的纯度、等电点、二级结构以及分子构象 ;采用妊娠兔肝细胞放射受体分析法 (RRA)检测单聚PEG GH的体外受体亲和力 ,采用未成年去垂体大鼠体重增加法检测体内生物活性。结果　分子筛高效液相图谱上仅出现一个峰 ,表明样品纯度很高 ,等电点范围为 5 .1～ 5 .2 ,与未修饰的rhGH的等电点相一致 ;CD谱与荧光光谱均表明单个mPEG ALD的修饰对rhGH的二级结构以及分子构象没有明显影响 ;与未修饰的rhGH相比 ,单聚PEG GH体外受体亲和力明显降低 ;但体内作用时间更长 ,且更加有效。结论　此结果为进一步研究和开发长效重组人生长激素提供了理论依据。     

重组大肠杆菌高密度发酵中乳糖诱导表达hBLyS

研究了乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达重组人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS). 结果表明,乳糖不仅能够作为诱导剂诱导外源蛋白的合成,而且能作为碳源促进菌体的生长. 通过对诱导条件进行优化,乳糖诱导外源蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14.3%,达到IPTG的诱导水平(26%)的55%. 在5 L发酵罐中hBLyS的表达量达到16%,同时生物量OD600=62.     

人血管内皮生长因子受体-Fc在DG44细胞中的表达及其生物活性

目的在中国仓鼠卵巢细胞DG44中表达人血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-Fc,并检测其生物活性。方法化学合成人VEGFR1的第2免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)基因和人VEGFR2的第3免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)基因,通过重叠PCR(Overlap PCR)将VEGFR1D2-VEGFR2D3和人IgG1Fc拼接形成VEGFR-Fc融合基因,插入真核表达载体pD2中,构建重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc,在FreeStyleTMMAX Reagent和OptiPROTMSFM介导下转染至DG44细胞中,MTX加压筛选稳定表达VEGFR-Fc蛋白的细胞株,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法检测细胞培养上清中VEGFR-Fc蛋白的表达。表达的VEGFR-Fc蛋白经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,利用显微镜观察法和血管内皮细胞ECV304模型检测其生物活性。结果 VEGFR-Fc基因扩增产物大小为1 377 bp;重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc经双酶切和测序证明构建正确;质粒pD2-VEGFR-Fc转染的DG44细胞培养上清中含VEGFR-Fc蛋白,表达量为0.5 g/L;细胞培养上清经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,杂蛋白去除效果较好;纯化的VEGFR-Fc能与VEGF特异性结合,抑制ECV304生长。结论成功在DG44细胞中表达了具有生物活性的VEGFR-Fc,为进一步研究其在抑制血管生成和抗肿瘤中的作用奠定了基础。     

HPLC法测定宣木瓜中芦丁含量

以反相高压液相色谱法测定宣木瓜中芦丁含量,结果表明在0.52-4.24μg/mL范围内其含量与峰面积呈良好线性相关(r为0.9988),样品中芦丁含量为0.574%.该方法快速、简便、准确,可在实际检测中用于控制宣木瓜药材质量.