骨化三醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用及相关机制

目的探讨骨化三醇(Calcitriol)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的治疗作用及相关机制。方法用含200μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55肽段(Myelin oligodendrocyte glycoprotein 33-35,MOG33-35)、250μg结核菌素的50μl弗氏不完全佐剂(IFA)皮内免疫C57BL/6小鼠,并分别于免疫当天和第2天注射百日咳毒素,建立EAE实验性动物模型(EAE组);骨化三醇组从免疫当天起隔日腹腔注射骨化三醇100 ng进行治疗,观察两组小鼠临床评分的差异;于EAE发病高峰期处死小鼠,取脊髓及淋巴结,通过HE及LFB染色观察脊髓中炎细胞浸润及髓鞘脱失;采用流式细胞术检测两组淋巴细胞CD4+T细胞亚型的分布。结果与EAE组比较,骨化三醇组发病延缓且发病较轻,临床评分差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001);骨化三醇组较EAE组小鼠脊髓白质炎性细胞浸润明显减少,脱髓鞘斑块明显减轻;骨化三醇组与EAE组相比,Th17细胞亚群明显受到抑制(P<0.05),而Th2和Treg细胞水平明显升高(P均<0.05)。结论骨化三醇可以延缓EAE发病,减轻临床症状及病理改变,并能够通过调节CD4+T细胞亚群平衡,即抑制Th17细胞,上调Th2和Treg细胞水平发挥对EAE的预防和治疗作用。     

骨髓基质干细胞对大鼠肝纤维化细胞凋亡的影响

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对大鼠肝纤维化细胞(CFSCs)凋亡的影响。方法常规培养BMSCs、CFSCs和大鼠肝细胞系BRL,并双层共培养CFSCs与BMSCs。用ELISA方法检测BMSCs培养上清中NGF、HGF和TGF-β1的浓度;RT-PCR检测与BMSCs共培养的CFSCs及BRL的p75表达;TUNEL法检测BMSCs分泌的细胞因子封闭后对CFSCs凋亡的影响。结果BMSCs可分泌NGF、HGF、TGF-β1等细胞因子,且随着培养时间的延长,其分泌量逐渐增多;BRL不表达p75,CFSCs表达p75,且与BMSCs共培养后,其表达量增高;分别用p75的阻断剂TAT-Pep5、HGF的中和抗体和JNK的阻滞剂sp600125作用后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例均明显降低;封闭TGF-β1后,BMSCs诱导CFSCs凋亡的比例增高。结论BMSCs能够通过分泌NGF和HGF促进CFSCs的凋亡,这种凋亡诱导作用依赖于JNK的活性,并且在封闭TGF-β1后增强。     

氧糖剥夺条件下PC12细胞RAGE的表达及对其损伤的影响

目的探讨大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞在氧糖剥夺(OGD)的条件下,晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达及其对PC12细胞损伤的影响。方法PC12细胞随机分为3组:OGD培养组(PC12细胞在无血清无糖的DMEM培养液中厌氧培养);封闭RAGE的OGD培养组(PC12细胞在加5μg/mlRAGE抗体的无血清无糖DMEM培养液中厌氧培养);对照组(PC12细胞在无血清无糖DMEM培养液中培养)。免疫组化法检测RAGE表达。收集细胞上清液,检测乳酸脱氢酶(LDH)活性和一氧化氮(NO)含量,并对细胞死亡率进行检测。结果在OGD条件下PC12细胞培养8、11、20h均有RAGE表达,与对照组相比表达均明显增加,OGD培养组与封闭RAGEOGD培养组相比,LDH活性差异显著。随着厌氧时间的延长,PC12细胞死亡率明显增高,封闭RAGEOGD培养组与OGD培养组相比,PC12细胞死亡率明显降低。NO含量差异无显著意义,但与对照组相比差异显著。结论在OGD条件下,PC12细胞RAGE表达增高。RAGE的表达对细胞的损伤起促进作用。     

转化生长因子-β在骨髓间充质干细胞治疗实验性自身免疫性重症肌无力机制中的作用

目的探讨转化生长因子-β(TGF-β)在骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)机制中的作用。方法分离培养健康Lewis大鼠BMSCs,并进行大量体外扩增;以大鼠来源的乙酰胆碱受体(R-AChR)2次免疫Lewis大鼠,建立EAMG模型;第2次免疫的同时,经尾静脉移植BMSCs,1×107个/只,依据Lennon评分标准,进行体重测量和临床体征评定。并通过体外实验进一步探讨TGF-β在治疗EAMG过程中的具体机制。结果BMSCs移植明显缓解了EAMG的临床症状,临床评分及体重变化差异均有统计学意义,表明治疗有效;体外实验结果显示,BMSCs能通过TGF-β的分泌影响AChR特异性Th17/Treg细胞亚群的分布及其相关因子的分泌,以anti-TGF-β抗体封闭后,这种调节作用在一定程度上被抑制。结论BMSCs通过细胞因子TGF-β,能在一定程度上调节AChR特异性Th17/Treg细胞亚群的平衡,从而起到治疗EAMG的作用。     

B细胞在MOG_(35-55)诱导的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用

目的探讨B细胞参与MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encelphalomyelitis,EAE)小鼠模型的可能机制。方法采用MOG35-55肽段免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型;采用临床评分检测EAE模型建立情况,HE和快蓝染色观察脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘状况,流式细胞术检测B细胞活化程度,免疫组化法检测脾组织生发中心的形成,ELISA法检测IgG1、IgG2a和IgG2b的分泌水平。结果成功建立了MOG35-55诱导的EAE小鼠模型,EAE组临床评分明显高于弗氏完全佐剂(Complete Freund adjuvant,CFA)组(P<0.001),EAE组小鼠脊髓可见明显的炎性细胞浸润和脱髓鞘斑块;在EAE组发病起始期(免疫后第5天和第8天),外周免疫器官活化B细胞表达水平明显高于CFA组(P<0.01);在发病高峰期(免疫后第15天)EAE组小鼠脾中形成生发中心,而CFA组未见生发中心形成,且外周血抗MOG35-55抗体分泌水平明显高于CFA组(P<0.005)。结论 MOG35-33肽段可以诱导B细胞活化,进而可能通过发挥体液免疫作用介导EAE疾病的发生。     

Th17及IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力发病过程的相关性

目的探讨Th17及其相关因子IL-17与实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)发病过程的相关性。方法建立EAMG大鼠模型及CFA对照组,分别于两发病时相(早期发病高峰和晚期发病高峰),采用ELISA法检测血清以及淋巴细胞培养上清中IL-17的含量;流式细胞仪检测CD4+IL-17+淋巴细胞含量;3H增殖试验检测淋巴细胞的增殖能力;B-ELISPOT法检测B细胞的抗体分泌情况。结果与CFA组相比,EAMG组大鼠血清、淋巴细胞培养上清中IL-17的表达以及CD4+IL-17+淋巴细胞含量在早期发病时相差异均无统计学意义;而在晚期发病时相则均明显增多。与非刺激组相比,IL-17的刺激对CFA和EAMG组淋巴细胞的增殖能力及B细胞抗体分泌水平,在早期发病时相均无明显影响;而在晚期发病时相,EAMG组均明显升高。结论Th17及其相关因子IL-17参与大鼠EAMG的晚期发病时相,并促进疾病的发展。     

IL-17对髓鞘碱性蛋白诱导鼻黏膜免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响

目的探讨IL-17对髓鞘碱性蛋白(MBP)68-86诱导鼻黏膜免疫耐受治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的影响。方法将大鼠分为5组,分别经鼻黏膜滴注PBS、MBP68-86、MBP68-86+IL-17(0.01μg/d)、MBP68-86+IL-17(0.05μg/d)和MBP68-86+IL-17(0.1μg/d)诱导其发生免疫耐受,并在此基础上建立EAE动物模型,观察各组大鼠发病情况;通过3H掺入试验检测特异性抗原MBP68-86多肽诱导T淋巴细胞增殖活性;HE染色观察脊髓淋巴细胞浸润情况,免疫组化方法检测脊髓中单位面积IL-17+细胞数。结果PBS组和IL-170.1μg/d组与MBP组相比,大鼠免疫后出现进食减少、体重减轻、尾瘫、后肢瘫痪等临床症状,IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组大鼠临床症状较轻或无症状。淋巴细胞增殖试验结果显示,PBS组和IL-170.1μg/d组与MBP组相比,特异性淋巴细胞增殖反应显著增高,IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组与MBP组相比,差异无显著意义,与IL-170.1μg/d组相比差异有显著意义;PBS组、IL-170.1μg/d组与MBP组、IL-170.01μg/d组和0.05μg/d组相比,脊髓切片中淋巴细胞浸润面积较大且细胞数量较多,IL-17+细胞数也显著增多。结论MBP68-86特异性肽段可诱导EAE免疫耐受的形成,预防EAE的发生;鼻黏膜给予IL-17可以打破MBP诱导的特异性免疫耐受,且存在剂量依赖性。     

骨髓间充质干细胞对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对大鼠脑胶质瘤C6细胞系分化的影响及其相关机制。方法用Transwell小室共培养BMSCs与C6细胞,采用细胞计数法检测C6细胞增殖水平;流式细胞术检测C6细胞的细胞周期;免疫荧光与免疫组化法分别检测波形蛋白(vimentin)和胶质纤维酸性蛋白(Glia lfibrillary acidic protein,GFAP)的表达;生化法检测谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的活性。结果 BMSCs对C6细胞的增殖具有抑制作用;与BMSCs进行双层培养72h的C6细胞出现G0/G1期细胞周期阻滞,双层培养组的C6细胞GFAP表达明显增强,同时vimentin表达减弱,并且这两种分化标志物在细胞内的分布及排列发生了改变;双层培养组C6细胞内GS活性升高。结论 BMSCs能诱导C6细胞向成熟星形胶质细胞分化,可能与BMSCs分泌的某些细胞因子有关。     

辅助性CD4~+ T细胞亚群失衡在实验性自身免疫性重症肌无力大鼠发病机制中的作用

目的研究实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)大鼠发病过程中辅助性CD4+T细胞亚型的变化。方法将Lewis大鼠分为完全弗氏佐剂(CFA)早、晚期发病时对照相和EAMG早期(初次免疫后13d)、高峰期(初次免疫后50d)发病时相4组,各组分别给予相应的药物后,于发病早期和高峰期分离淋巴细胞,采用流式细胞术检测各组大鼠淋巴细胞中Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例,ELISA法检测淋巴细胞培养上清中各种细胞因子水平。结果在EAMG发病的早期时相,与CFA组比较,EAMG组Th1、Th2、Th17细胞的比例下降,而Treg细胞比例上升;淋巴细胞培养上清中IFNγ和IL-4水平显著下降(P<0.05),IL-6水平显著升高(P<0.05),IL-17和TGF-β水平略升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。在EAMG发病的高峰期,与CFA组比较,EAMG组Th1和Th17细胞的比例显著上升(P<0.05),而Th2和Treg细胞的比例显著下降(P<0.05),淋巴细胞培养上清中IFNγ和IL-17水平显著上升(P<0.05),IL-4和TGF-β水平显著下降(P<0.01),IL-6水平略上升,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论在EAMG发生过程中,4种辅助性CD4+T细胞亚型之间的平衡被打破,晚期时相中Th1和Th17细胞比例上升,而Th2和Treg细胞比例下降。     

外水相对胰岛素载药纳米颗粒胶体系统分散性的影响

目的探索不同外水相组成对胰岛素纳米颗粒胶体系统分散性的影响,为深入开展纳米载药颗粒研究提供依据。方法采用高速高压联合均质机,经乳化-溶剂挥发法制备不同粒径的纳米载药颗粒,再通过光学显微镜、扫描电镜、激光粒径分析仪分析颗粒在胶体系统中的分散情况。结果高速均质和高速高压均质聚乙烯醇组粒径分布(d50)分别为(5·410±0·487)μm和(0·389±0·034)μm,高速均质和高速高压均质偏磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液组粒径分布(d50)分别为(5·505±0·854)μm和(0·204±0·020)μm。联合均质结果缓冲液组粒径分布小于聚乙烯醇组,颗粒表面光滑平整;比表面积与之相反,聚乙烯醇组低于缓冲液组。结论偏磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液作为乳化-溶剂挥发法制备胰岛素纳米载药颗粒的外水相,能够获得更好的分散体系。