人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

靶向细菌细胞壁新型食品保鲜剂的虚拟筛选

食品保鲜剂种类繁多,然而很多保鲜剂仅对革兰氏阳性菌有效,对革兰氏阴性菌的抑菌效果较差。为了开发对革兰氏阴性菌和阳性菌均具有较好抗菌活性的新型食品保鲜剂,以铜绿假单胞菌的粘肽合成酶PBP3和大肠杆菌的粘肽合成酶PBP1b,PBP4和PBP5为靶点,通过分子对接软件DOCK6.5,对含有580万个小分子化合物的ZINC数据库进行大规模虚拟筛选,从中选出一种打分较高且结构新颖的先导化合物进行有机合成。以山梨酸钾为阳性对照,测定先导化合物对冷鲜肉的保鲜效果,结果表明,先导化合物处理组除了色差略逊于山梨酸钾组外,其pH值、菌落总数、挥发性盐基氮、汁液流失率等指标均优于后者。同时,二者的保鲜效果均显著优于空白对照组。研究结果证明了先导化合物对冷鲜肉具有更优异的保鲜效果,有望进一步将其开发为新型食品保鲜剂。     

辣木叶黄酮结构分析及其对胰脂肪酶的抑制作用

对辣木叶中黄酮类化合物的结构进行分析,并测定其对胰脂肪酶的抑制作用及抑制作用类型。以70%乙醇溶液为提取溶剂,用微波辅助提取法提取辣木叶黄酮,提取率达到（5.53±0.11）%;用聚酰胺层析柱对获得的粗提物进行纯化,冷冻干燥得到样品粉末,测定其总黄酮含量为（661.10±9.20）mg/g。借助超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱联用技术对纯化后的辣木叶黄酮结构进行分析,共鉴定出11?个黄酮类化合物。以对硝基苯丁酸酯为底物,测定了辣木叶黄酮对胰脂肪酶的抑制活性,结果表明纯化后的辣木叶黄酮对胰脂肪酶有较好的抑制作用,半数抑制浓度（IC50）为0.94?mg/mL,通过Lineweaver-Burk法测定出其抑制作用类型为非竞争性抑制。     

响应面试验优化羟丙基-β-环糊精包合植物甾醇的水溶性改性工艺

为增加植物甾醇(phytosterol,PS)的水溶性,拓宽其在食品领域中的应用,本研究采用羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)对植物甾醇进行包合,达到增大其水溶性的目的。采用差热扫描分析、傅里叶红外光谱和X射线衍射对包合后的产物进行检测。同时,采用单因素和响应面试验对包合工艺进行优化,得到最佳包合工艺为HP-β-CD与PS物质的量比4.27∶1、包合温度47℃、包合时间11.93 h,得到的包合率为96.57%。考虑到实际操作的便利,将其修正为:HP-β-CD与PS物质的量比4.30∶1、包合温度47℃、包合时间12 h,并在此修正条件下进行3次平行实验,其平均包合率为97.25%。结果表明在包合状态下,经改造后的PS在37℃水中的溶解度得到了大幅度提高,达到了8.31 mg/m L,是其原来(0.027 mg/m L)的307.90倍。