PRELPshRNA稳定转染Saos-2细胞系的构建及鉴定

目的构建PRELP(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)基因sh RNA慢病毒表达载体,并对其在Saos-2细胞中沉默效果进行鉴定。方法针对PRELP m RNA设计2对干扰序列,化学合成后插入至慢病毒载体,将慢病毒载体以不同MOI值分别转染Saos-2细胞,筛选细胞内GFP阳性率最高MOI值。将合成的慢病毒载体以筛选出的MOI值分别转染细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,Western blot法验证两株稳定转染细胞株PRELP下调效率。结果成功构建PRELP sh RNA慢病毒载体,当MOI为50~70时,细胞内荧光蛋白表达阳性率最高;嘌呤霉素筛选到稳定转染的细胞株;构建的稳转细胞系均特异性抑制PRELP蛋白的表达。结论成功构建了PRELP sh RNA慢病毒载体,并建立稳定的Saos-2细胞PRELP下调表达细胞模型,为研究PRELP在骨关节炎中的作用奠定了基础。     

人胰液双向凝胶电泳分离技术的建立和优化

目的建立并优化人胰液蛋白质组的双向凝胶电泳分离方法。方法通过比较几种常用的体液处理方法,确定了一种适于人胰液的蛋白质样品处理方法。经过一维等电聚焦和二维SDS-PAGE电泳后,有效分离了人胰液蛋白质组。结果通过优化胰液蛋白质提取、上样量和固相IPG胶条分离范围的选择等步骤,建立了人胰液双向凝胶电泳的方法,并获得了分辨率较高、重复性较好的双向凝胶电泳图谱。结论丙酮沉淀与双向凝胶电泳技术的结合是研究人胰液蛋白质组的一种有效的方法。胰液双向凝胶电泳方法的优化可为今后开展疾病相关的胰液蛋白质组学研究提供技术基础。     

牙本质基质蛋白1功能片段的融合表达及其胞内定位

目的构建含单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点不同碱基的37 kD的N-牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)和全长DMP1基因重组表达质粒,并分析重组蛋白在HEK293细胞中的表达及定位。方法利用定点突变改造DMP1基因,获得DMP1基因的SNP rs10019009的不同基因型,将含SNP位点不同碱基的37 kD N-DMP1和全长DMP1基因定向克隆入含增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP,通过脂质体法瞬时转染HEK293细胞,荧光显微镜观察重组融合蛋白DMP1-EGFP的表达及胞内定位。结果 DNA测序结果表明,定点突变后的DMP1基因的碱基序列与设计序列完全一致;PCR和DNA测序显示重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP构建正确;融合蛋白DMP1-EGFP在HEK293细胞中主要表达于细胞胞浆中。结论成功构建了含rs10019009-SNP位点不同碱基的37 kD的N-DMP1和全长DMP1基因重组表达质粒,并在HEK293细胞的胞浆中有效表达,为进一步研究DMP1基因的功能奠定了基础。     

用于体液肽表达谱分析的快速肽段提取方法

目的探讨基于ZipTipC18的肽段提取方法在疾病临床诊断中的应用价值。方法用基于ZipTipC18和磁珠的体液肽段提取方法分别提取正常胰液、胰腺癌胰液和正常血液中的肽段,进行体液肽表达谱的PMF分析,对所得数据进行标准化处理,对目的肽段进行TOF/TOF分析鉴定。结果通过质谱分析得到了反映样品蛋白构成的肽表达谱。基于ZipTipC18的肽段提取方法获得的数据准确、可靠,重复较好,通过TOF/TOF分析,血液样品中的肽段鉴定为fibrinogen α链前体。根据正常胰液与胰腺癌胰液的差异肽表达谱,可将癌症患者与正常对照者明显区分。结论基于ZipTipC18的肽段提取方法可作为疾病(尤其是癌症)的辅助诊断方法。