烟草突变体筛选与鉴定方法篇:2.烟草抗主要病虫害突变体的筛选与鉴定

参照烟草品种抗病性鉴定标准GB/T 23224—2008,烟草基因组计划重大专项"烟草突变体创制、筛选与分析"建立了烟草抗病毒病、青枯病、黑胫病、赤星病、烟蚜的高通量筛选方法,将全面开展烟草抗主要病虫害突变体的大量筛选与鉴定工作。     

拮抗细菌对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用研究

从发生烟草花叶病毒(TMV)的烟田耕作层土样中分离到对TMV有拮抗作用的菌株By33和By88。生物测定试验表明,By33和By88的无菌发酵液对TMV的体外抑制作用分别为81.81%和83.29%,涂抹菌液24 h后接种TMV,仍有73.01%和66.98%的预防作用。硫酸铵沉淀无菌发酵液、PBS透析获得拮抗蛋白;拮抗蛋白对TMV的体外抑制作用分别为85.38%和87.47%,并且在274.00 nm处有明显的蛋白吸收峰,为典型的蛋白质吸收光谱。此外,通过叶圆片法和透析法生物测定表明,抗病毒蛋白与TMV粒子结合作用为不可逆,有抑制TMV在烟株体内复制的作用。     

粘质沙雷氏菌高产发酵灵菌红素的工艺优化及抗病毒活性

为提高粘质沙雷氏菌S3菌株的灵菌红素产率,本研究对粘质沙雷氏菌S3发酵过程中重要的发酵条件参数和关键组分进行逐项优化,并验证了发酵液灵菌红素提取物对本氏烟草病毒的抑制效果。结果表明,最佳培养基配方为：丙三醇0.5%,蛋白胨1.5%,氯化钠0.5%,氯化钾0.25%;最佳发酵条件为：接种量为10%,装液量为60%~70%,pH恒定为6.0,培养温度为28℃,振摇速度160r/min,发酵周期为60h。在该发酵条件下,既有利于粘质沙雷氏菌菌体生长,又能够使灵菌红素的产量达到最大化。按照该优化条件进行发酵后,其灵菌红素提取物溶液喷施于接种TMV、CMV和PVY的本氏烟,烟叶中TMV、CMV和PVY病毒量分别为空白对照的12.61%、29.41%和17.69%,对病毒的抑制效果优于氨基寡糖素。试验所得的发酵制备条件能够提高灵菌红素产量,提取物具备显著抗病毒特性,具有产业化开发潜力和经济应用价值。     

烟草抗病毒病种质资源的鉴定与评价

2005-2006年采用温室苗期接种鉴定的方法对202份烟草种质进行了TMV、CMV以及PVY三种病毒病的抗性鉴定。结果表明:在供试种质中,对TMV表现免疫(21份)、抗病(1份)和中抗(30份)的材料共52份,表现中感(130份)和感病(20份)的材料共150份;对CMV表现抗性(4份)和中抗(20份)的材料共24份,表现中感(79份)和感病(99份)的种质共178份;对PVY表现免疫(1份)、抗病(2份)和中抗(33份)的材料共36份,表现中感(96份)和感病(70份)的材料共166份。所筛选的优质、抗病烤烟引进品种白色种、晒烟大るま以及香料烟KoKulu izmir可直接应用于烟草生产,另外对TMV表现免疫的材料白肋烟8301、黄筋蔸、抗3种病毒病的种质黄花烟阳高小兰花以及兼抗两种病毒病的种质可为烟草抗病毒病育种的亲本选择提供抗源。     

山东烟草病毒病发生特点及防治对策

对山东烟区烟草病毒病发生特点进行了分析,预测了未来几年烟草病毒病的发生趋势,并提出了烟草病毒病的防治方法。病毒病的防治应从改良品种、改善农业生态环境等方面着手,以改进农事操作方式方法、优化耕作制度为主,辅以少量低毒、低残留的农药进行系统综合防治,真正做到预防为主,综合防治。     

抗病毒病K326新品系Y48抗TMV的细胞学机制研究

Y48是对主栽烤烟品种K326的病毒病抗性进行定向改良培育出的新品系,在保持原K326其他性状不变的前提下,对TMV和CMV抗性显著提高。为揭示其在细胞学方面的抗病机制,本研究利用透射电子显微镜（TEM）对TMV接种0~72 h后的K326和Y48叶片进行超微结构观察。结果显示,K326接种24 h时,叶绿体类囊体片层减少,线粒体膨大,胞内出现自噬结构,接种72 h时,叶绿体、线粒体被病毒完全破坏,叶肉细胞病理性坏死;而Y48,在接种48 h时才发生叶绿体内部沉积少量颗粒,线粒体嵴消失,胞内出现降解的囊泡,接种72 h叶绿体,线粒体全部降解,细胞质凝集,叶肉细胞程序化死亡。结果表明,相对于K326,Y48可以延迟TMV病毒的侵染,并启动超敏反应,发生HR-PCD,并且Y48接种8 h后出现过氧化物酶体,可能影响细胞内ROS代谢水平,二者或许是Y48对TMV表现抗病的细胞学证据,研究结果为进一步解析Y48的抗病分子机理奠定了基础。     

两株根际促生细菌对TMV的生防作用研究

烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是危害烟草的主要病毒之一,其寄主范围广、侵染力和抗逆性强,尚无有效的抗病毒药剂。利用植物根际促生细菌（PGPR）对寄主的促生以及对病毒的钝化作用进行病毒病早期预防,是控制TMV的有效途径。本文对筛选到的两株PGPR菌株Sa和Sk进行了菌株鉴定及促生和防病作用研究。结果表明:Sa为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、Sk为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。在霍格兰氏营养液中添加Sa、Sk的发酵上清液,能显著促进烟苗的根系发育和茎叶生长;“半叶法”试验结果显示Sa、Sk的发酵上清液能在体外钝化TMV,并且Sa的粗蛋白溶液、去蛋白上清、蛋白失活后的粗蛋白溶液对TMV的抑制效果分别为85.2%、83.1%、36.2%,说明Sa的发酵物中对TMV起钝化作用的活性物质主要包括蛋白和非蛋白两类;Sk的粗蛋白溶液、去蛋白上清抑制TMV的效果分别为88.0%、0%,说明Sk的发酵物中对TMV起钝化作用的活性物质主要为蛋白类。利用TMV30B侵染性克隆,观察到Sa、Sk发酵上清液能显著抑制病毒的初侵染。室内栽培烟株喷施Sa、Sk发酵上清后,对TMV的防效分别为27.71%和18.55%。芽孢杆菌Sa生防效果好于Sk,具备抗病毒剂的开发潜力。      

层层自组装法制备百里香精油微胶囊条件优化

采用层层自组装的方法,以百里香精油乳化液纳米微粒作为核心,利用壳聚糖和海藻酸钠对百里香精油进行包埋;以司盘80和吐温60复配乳化剂亲水亲油平衡（hydrophilic lipophilic balance,HLB）值、用量及油乳比例3 个因素进行实验,确定乳化液最适制备条件;以壁材溶液质量浓度、组装层数、每层组装时间、搅拌速率、组装温度、壁材溶液pH值和固化剂用量进行单因素试验,以主要因素设计正交试验,确定最佳包埋条件。结果表明,乳化液制备条件为HLB值10、乳化剂用量6%、精油与乳化剂体积比1∶6,此条件下所制备的乳化微粒为模板,组装层数4 层、搅拌速率1 040 r/min、每层组装时间15 min、壁材溶液pH 5.0、组装温度30 ℃,此条件下包埋率最高为80.23%。     

拮抗细菌活性蛋白诱导烟草对CMV的抗性研究

从烟田耕作层土样中分离到对CMV有拮抗作用的细菌菌株B6,通过离子交换层析和凝胶过滤层析初步确定其活性物质是分子质量大小为40．6kD的蛋白质。活性蛋白诱导后,对烟草叶片的病毒含量、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的活性变化进行研究。结果表明,拮抗细菌活性蛋白诱导后烟草叶片内CMV含量明显降低,随着诱导天数的增加病毒的含量呈由多到少再增多的变化趋势,POD,PAL和PPO等细胞防御酶的活性增强。     

恶臭假单胞菌发酵条件的研究

从未发病的K326烟株根际土壤中筛选出对TMV具有高度拮抗活性菌株A3,发酵液的抑制效果可达95%以上,为此,从碳源、氮源、pH、温度、通气量及发酵时间等方面对该菌株的摇瓶发酵条件进行研究。结果表明,A3菌株发酵适宜温度为28 ℃,在该温度下发酵60～70 h达到菌体最大数量,且抑菌效价最高;以葡萄糖为适宜的碳源可以更好的促进菌量的生长和抗病毒物质的分泌,有机氮中酵母膏或蛋白胨对菌株的生长和抗病毒活性成分生成均能达到理想的效果,鱼粉则不能被A3菌株很好的利用;pH 7是菌株最适宜的发酵范围,偏酸不利于菌株的生长;适当加大通气量能更好地促进A3菌株的繁殖及抗病毒物质的分泌。