马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选

为探索马氏珍珠贝肉的水解规律及快速鉴定血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性肽,本研究以不同时间（2、4、6、8、10 h）的酶解物为对象,采用三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子质量分布、反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）表征其水解规律。另外,对10 h酶解物进行初步分离纯化,鉴定高活性组分中的肽序列,并采用分子对接的方法对鉴定的肽进行筛选,验证筛选肽的活性,阐释其抑制机理。结果表明,马氏珍珠贝肉在酶解过程中,大分子质量蛋白逐渐水解为小分子肽,在RP-HPLC上出现某一特征峰的富集。初步分离后,发现F2、F3组分具有较高的ACE抑制活性,从这2 个组分中共获得了可信度较高的54 个肽序列。分子对接筛选出6 个潜在的ACE抑制肽,在1 mg/mL时,5 个肽具有不同程度的ACE抑制活性,其中,WFHAVFW和WHAFLW显示了最高的ACE抑制活性,分别为（95.57±0.37）%和（98.59±0.08）%,进一步测定六肽WHAFLW的半抑制浓度（IC50）值,为52.39 μmol/L。分子对接显示肽的抑制机理可能是通过氢键、范德华作用以及Pi-Pi作用形成稳定的肽-酶复合物。本研究既揭示了珍珠贝肉蛋白不同酶解时间的规律变化,又将活性实验跟踪与计算机辅助筛选相结合,提供了一种快速筛选酶解物中高活性ACE抑制肽的方法。     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。