克雷伯氏菌产β-半乳糖苷酶的异源表达及低聚半乳糖合成工艺优化

β-半乳糖苷酶是低聚半乳糖制备过程中的关键酶。本文克隆生菌株克雷伯氏菌B5582Y的β-半乳糖苷酶基因lacZ,并成功构建大肠杆菌重组质粒pET28a-24。经IPTG诱导表达其酶活力比野生菌株提升近10倍。通过单因素及响应面法考察重组酶对低聚半乳糖合成的影响,得到最佳工艺条件为:加酶量130 U/mL,温度44℃,底物添加量90%,pH 7.0～7.5,反应时间10 h,低聚半乳糖的产率达44%。重组酶表现出较好的转糖苷活性,在低聚半乳糖合成领域具有较大的应用潜力。     

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究

研究了反应时间、乳糖浓度、温度、加酶量、pH对低聚半乳糖合成的影响,结果表明,加酶量、乳糖浓度、反应温度的影响较大。通过正交实验确定的米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳工艺条件为:pH6.0、温度55℃、乳糖浓度40%、加酶量40U/g、反应时间32h。在最佳工艺条件下,低聚半乳糖的合成率为32.4%。     

以乳清为底物固定化β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖

以海藻酸钙凝胶包埋法固定化β-半乳糖苷酶,处理乳清制备低聚半乳糖(GOS).经单因素试验和响应面分析(RSA),优化结果当反应时间为2.0h,乳清溶液中乳糖含量为37.4%,温度为58.2℃,pH为5.0～6.0,加酶量为0.14%时,GOS得率最高,理论值为28.9%.50mL试验GOS得率为29.1%.1L的试验GOS得率为28.3%,试验结果与理论值无显著性差异.     

环氧基载体固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

采用悬浮聚合法制备了表面含有活性环氧基的载体,研究了初始酶浓度及反应时间对该载体固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶效率的影响,应用环氧基载体固定化酶催化合成低聚半乳糖,探讨影响低聚半乳糖合成量的因素.结果表明:制备的环氧基载体为单一分散、近似球形、粒径约为150～200μm的球体.初始酶浓度为4.0mg/m L,环氧基载体对K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶的固定化量达到最大值,为69.8mg/g载体,初始酶浓度为3.0mg/m L时,固定化酶的活力回收率最大,约为70％.固定化的酶量随着固定化的时间增加而增加,固定化10h时酶量达到最大值.固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适底物浓度为150g/L,反应4h GOS的产率达到最大,为40g/L.     

乳酸克鲁维酵母乳糖酶合成低聚半乳糖的研究

低聚半乳糖因其具有优越的生理功能而获得广泛关注。利用乳酸克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶水解乳糖进行酶法合成低聚半乳糖的研究,应用薄层层析定性、HPLC-ELSD定量技术对低聚半乳糖进行分析,并对其合成条件进行优化。β-半乳糖苷酶水解乳糖合成低聚半乳糖的最佳反应条件为:底物(乳糖)浓度50%、加酶量40 U/g、p H7.5、50℃,以上条件下反应2 h,低聚半乳糖产率为23.4%。     

海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了强化海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶的方法以及固定化酶的性质,并用于制备低聚半乳糖。研究表明,用海藻酸钙包埋、戊二醛进行交联、对β-半乳糖苷酶进行固定,方法简便、酶的活力回收率高。所得固定化酶强度和活力高,对热、pH值耐受范围较游离酶宽,最佳反应温度和pH与游离酶相同,且贮存稳定性好。以乳糖为原料,用海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖,随着时间的延长,低聚半乳糖合成率呈抛物线变化。在温度55℃、pH6.0、乳糖浓度40%、反应时间为30h时,低聚半乳糖的合成率达最大值36.37%。     

β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖

通过对环状芽孢杆菌B.circulans SK28.003的发酵获得β-半乳糖苷酶酶液,经过浓缩、盐析沉淀和低温冷冻干燥,制备酶粉。利用β-半乳糖苷酶的转糖苷功能催化乳糖合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS),采用单因素和正交试验优化,通过高效液相色谱法检测,以GOS产率为评价指标,确定最佳合成条件为:乳糖起始质量浓度为50 g/d L,加酶量为6 U/g,反应温度为60℃,p H 7.5。在此条件下反应12 h,GOS产率可达45.5%。     

响应面法优化β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖工艺

本文以乳糖为起始原料,在单因素实验的基础上,结合响应面分析法考察加酶量、反应温度、反应时间、反应pH等因素对低聚半乳糖总产率和低聚半乳四糖产率的影响,优化β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖工艺。结果表明,β-半乳糖苷酶法制备低聚半乳糖的最佳工艺参数为起始乳糖浓度300 g/L、加酶量8.25 U/g乳糖、反应温度49 ℃、反应时间16 h、反应pH5.6。在此条件下,低聚半乳糖总产率为14.61%,低聚半乳四糖产率为3.31%。该方法针对性提高高聚合度低聚半乳糖的产率,可为低聚半乳糖的功能性应用及特医食品的研发提供参考。     

Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

低聚半乳糖具有促进肠道有益菌增殖、抗龋齿、低能量等特定的生理功能。研究了酶反应条件对脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响。以乳糖为底物,k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,反应20h低聚半乳糖的产率达到最大。底物初始浓度影响k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的产率,乳糖起始浓度由110mg/mL增加到660mg/mL,低聚半乳糖的含量从43mg/mL增加到207mg/mL。     

低聚半乳糖合成研究现状与产业的发展趋势

低聚半乳糖是一种功能性低聚糖,具有卓越的生理功能,作为一种新型的食品营养强化剂,近年来逐渐成为国内外学者研究的热点。根据国内外近二十年的研究资料,本文综述了以乳糖为底物,利用β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的反应机制;讨论了乳糖底物的初始浓度、反应体系中的水活度、反应温度、反应pH、抑制物(半乳糖、葡萄糖、低聚半乳糖产物)、反应时间等因素对低聚半乳糖产率的具体影响;总结了不同来源的β-半乳糖苷酶的类型、最佳反应条件下低聚半乳糖的产率,工业化低聚半乳糖的生产工艺流程;并对目前市场上销售的商用低聚半乳糖产品及其成分进行了介绍,探讨了目前制约低聚半乳糖产业在我国大规模发展的因素,以期促进我国低聚半乳糖产业的发展。     

传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。     

植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖的工艺优化

以乳糖为底物,利用含β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖(GOS).在5L发酵罐上进行了以乳糖为碳源的植物乳杆菌WZ011的厌氧培养,β-半乳糖苷酶产量在发酵14 h时达到最大值5 U/mL.收获的植物乳杆菌菌体用于透性化全细胞催化生产GOS的研究.比较了乙醇、Tween 80、SDS、DMSO、丙酮这五种渗透剂对胞内β-半乳糖苷酶酶活的影响.结果表明以40％乙醇作为渗透剂处理最为有效,β-半乳糖苷酶胞内酶活可达500 U/g(细胞干重DCW).进一步对40％乙醇渗透处理后整细胞催化生产GOS的工艺条件进行了研究,结果表明乳糖浓度、初始pH、温度和反应时间对GOS合成均有显著影响.在乳糖质量浓度为400g/L,初始pH为7.0,温度50℃及反应进行10h的条件下,GOS产量达到最大值32％(质量分数).     

离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

建立以电化学脉冲安培-离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量(galactooligosaccharides,GOS)的方法。首先采用离子色谱法检测经β-半乳糖苷酶酶解的原料糖浆试样中GOS含量,再以测得GOS含量的同批次原料糖浆作为对照品,检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量。对仪器色谱条件及前处理方法进行比较优化。结果发现,该方法线性关系良好,相关系数0.999 7,RSD为3.5%,加标回收率87.7%～92.4%。     

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH 值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对oNP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。     

重组β-半乳糖苷酶的制备及转化条件优化

以前期构建的产Bacilluscirculansβ-半乳糖苷酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-lac为菌种,进行摇瓶发酵诱导培养,培养24 h胞外上清酶活达15 U/mL。利用制备的β-半乳糖苷酶粗酶液进行酶转化实验。优化了酶转化条件,考查了初始pH、反应温度、乳糖质量浓度、加酶量和反应时间等因素对低聚半乳糖产率的影响。确定最优转化条件为:初始pH 6.5、反应温度55℃,起始乳糖质量浓度为700 g/L,加酶量为8 U/mL。在此条件下反应16 h,低聚半乳糖转化率可达57%。     

β-半乳糖苷酶全细胞催化制备低聚半乳糖工艺优化

β-半乳糖苷酶能以乳糖为底物生产低聚半乳糖。利用前期构建的产β-半乳糖苷酶F441Y重组毕赤酵母为菌种,进行摇瓶发酵并诱导培养。酵母菌体经过离心、洗涤后作为全细胞催化剂用于转化乳糖制备低聚半乳糖。为了提高转化率,首先通过单因素实验,优化了反应的初始p H、温度、乳糖浓度、加酶量和反应时间等因素。在此基础上,采用正交实验进一步优化了反应条件,优化后的最佳条件为:反应初始p H 6.0,反应温度为80℃,乳糖浓度为80%(w/v),加酶量为5 U/m L。在最佳转化条件下,反应24 h,低聚半乳糖的最高转化率为59.9%。与游离酶转化方法相比,该反应体系中的杂蛋白和美拉德反应较少,更有利于低聚半乳糖产品的后续分离。该研究建立的全细胞酶转化方法,具有转化率高、简单易行以及容易操作等优点。     

β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究现状

β-半乳糖苷酶及低聚半乳糖对人体生理功能具有重要作用,本文对两者性质、作用机理及应用进行了概述,并着重介绍目前β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖应用较多的生产方法。     

产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及酶法合成低聚半乳糖的GC-MS分析

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高转糖基活性β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖(GOS),并采用GC-MS的方法对其各个组分进行鉴定。研究结果表明,菌株70810所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,其合成GOS产率达到39.23%(m/m);该菌株为实验室已鉴定乳酸菌,为植物乳杆菌(HQ259238)(Lactobacillus plantarum);酶法合成的GOS产物鉴定为9种低聚二糖和3种低聚三糖,主要结构多为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。菌株70810来源于泡菜,安全性好,所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,且可不经纯化直接利用,在食品与乳品加工等方面将具有很好的应用前景。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

响应面法优化低乳糖奶水解工艺

牛奶及乳制品营养丰富,容易消化吸收,人称"白色血液",是最理想的天然食品。近年来我国乳业发展迅速,但与世界平均水平仍存在巨大的差距,制约我国乳业发展的一个重要原因就是乳糖不耐症。利用β-半乳糖苷酶对牛奶进行水解可生成易被人体吸收的葡萄糖、半乳糖及"双歧因子"低聚半乳糖,不仅能解决乳糖不耐症问题,还能增加牛奶的营养价值。本文在单因素初步试验的基础上,以低聚半乳糖合成率为响应指标,通过响应分析法对低乳糖水解工艺进行优化。结果表明,当反应温度为45.3℃、加酶量为2.5mL及反应时间为69.7min时,低聚半乳糖得率达到最大值6.15%。通过乳果糖试剂盒测定水解后低乳糖奶中乳果糖含量,平均含量为158.17mg/L。