A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。     

A群脑膜炎球菌兔抗血清的制备及鉴定

目的制备A群脑膜炎球菌兔抗血清内部参考品,并进行鉴定。方法用新鲜培养的A群脑膜炎球菌混悬液按确定的免疫方案免疫日本大耳白兔,免疫完成后,按确定的采血时间点,经颈动脉采血,分离血清,进行凝集试验,观察兔抗血清凝集反应情况;采用免疫双扩散和ELISA法检测兔抗血清效价,同时利用火箭免疫电泳和ELISA法鉴定兔抗血清的血清学特异性。结果确定免疫方案为基础免疫4周后,加强免疫2周;免疫完成后第6天为最佳采血时间点。6份自制A群脑膜炎球菌兔抗血清的凝集试验效价均达到1︰160,与相应的多糖能够产生沉淀线的最大稀释倍数均不低于1︰8,与A群脑膜炎球菌荚膜多糖反应的抗体滴度均在106及以上,与C、Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖之间无交叉反应。结论自制的A群脑膜炎球菌兔抗血清可作为A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的定性和定量检测的内部参考品,同时也为其他多糖类疫苗血清抗体的制备提供了参考。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测方法的建立

目的 建立A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量的HPLC检测方法,并对其进行验证。方法 采用HPLC法,色谱条件:色谱柱:TSKgel G3000SW(300 mm×7.5 mm,10μm);流动相:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液[pH(7.2±0.2)];流速:0.5 ml/min,自动进样100μl;检测波长:280 nm;柱温:室温。对该方法进行专属性、分离度、线性、精密性和准确性验证,确定该方法的定量限和检测限;应用建立的方法检测3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品中游离蛋白含量。结果 该方法检测游离蛋白的专属性、分离度良好;蛋白对照品在3~18μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R~2=0.998;3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品的加样回收率在82.9%~119.33%之间,RSD小于5%;确定方法检测限为1.0μg/ml,定量限为2.6μg/ml。3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品未检测出游离蛋白。结论 建立的HPLC法简便、灵敏、准确度高,可检测A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量。     

C群和W_(135)群脑膜炎球菌发酵工艺的优化

目的优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量。方法在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100L发酵罐中放大发酵。结果在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成。C群脑膜炎球菌在100L罐中放大发酵,多糖产量可达5L罐水平。结论通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的最佳发酵工艺。     

W135群脑膜炎球菌发酵培养条件的优化

目的优化W135群脑膜炎球菌发酵培养条件,提高荚膜多糖产量。方法通过30 L发酵罐培养W135群脑膜炎球菌,分析不同补加葡萄糖方式、发酵温度、接种量对发酵液中生物量和荚膜多糖产量的影响,优化培养条件;并对优化的工艺进行验证。结果 W135群脑膜炎球菌发酵培养优化条件为分批补加5 g/L葡萄糖,发酵温度为37℃,接种量为16%;2批W135群脑膜炎球菌精制多糖的核酸含量、蛋白含量、唾液酸含量、O-乙酰基含量、K_D值、回收率及多糖含量,均符合ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗质量标准。结论获得了更适宜W135群脑膜炎球菌的发酵培养条件,提高了荚膜多糖含量,为建立完整的发酵工艺奠定了实验基础。     

Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺的优化

目的优化Y群脑膜炎球菌多糖活化工艺,为A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗的研制奠定基础。方法分别以多糖衍化率和游离多糖含量为指标,按照三因素三水平正交试验,以不同的pH值、活化时间和活化剂加量对多糖进行活化后,与破伤风类毒素(TT)偶联,并经Sepharose4FF层析纯化后,对多糖-TT结合物进行各项生化检定、免疫原性检测及稳定性观察,确定最佳活化工艺,并对优化的工艺进行验证。结果以多糖衍化率为指标,可确定pH值和活化剂加量二因素对Y群脑膜炎球菌多糖的活化有显著影响(P<0.05),而以游离多糖为指标时,无法确定三因素对多糖的活化有显著影响(P>0.05),结合各项指标检测及稳定性观察结果 ,确定多糖活化最佳工艺为:在pH12条件下,向每mg多糖中加入等量活化剂,反应10min。采用优化的多糖活化工艺制备3批Y群脑膜炎球菌多糖-TT结合物,各项指标均符合多糖结合疫苗的常规质控标准。结论优化的多糖活化工艺可制备出游离多糖含量低、免疫原性高的Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物,结果具有重复性。     

A群流行性脑膜炎球菌多糖含量检测免疫速率比浊方法的建立及验证

目的应用免疫速率比浊方法测定A群流行性脑膜炎球菌多糖含量,并进行验证。方法采用免疫速率比浊方法测定A群脑膜炎球菌多糖标准品多糖含量,绘制标准曲线,对该方法的精密性、准确性、灵敏性进行验证,并进行干扰试验。结果多糖抗原浓度在0~10μg/ml之间,与相应的浊度值呈良好的线性关系,R2=0.984 3;该方法检测结果的日内和日间CV值均小于5%,不同浓度A-DT结合物样品的回收率在99.67%~102.00%之间,最低检出限为0.159μg/ml;加入C群流行性脑膜炎球菌多糖后的A群脑膜炎球菌多糖含量与未添加相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论免疫速率比浊方法测定A群脑膜炎球菌多糖含量具有较高的准确度、精确度及灵敏度,并具有较强的特异性。     

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。该疫苗安全性及免疫原性良好。结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。     

C群脑膜炎球菌家兔免疫血清的制备及其群特异性和相关方法专属性分析

目的制备C群脑膜炎球菌家兔免疫血清,并进行群特异性和相关方法专属性分析。方法用制备的C群脑膜炎球菌菌液免疫青紫兰家兔,经耳缘静脉注射8×109个/ml菌液,0.5~1.0 ml/只,每周1、3、5免疫,共免疫4周,于第6周开始加强免疫,每周2次,连续3周,于末次免疫1周后,经颈动脉采血,分离血清,采用免疫双扩散法检测血清效价。采用ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法分析其群特异性和相应方法专属性。结果建立了家兔免疫血清制备方法,制备的3份(1、2、3)免疫血清相应多糖抗体效价分别为1︰8、1︰8和1︰16。自制免疫血清1、3在使用工作浓度下,符合免疫学质量控制ELISA方法的特异性和专属性要求。自制免疫血清3可作为C群脑膜炎球菌结合物Western blot检测的Anti-PS血清,在该检测灵敏度下可完全达到与破伤风类毒素(TT)无交叉反应;血清1、2的轻微交叉反应可通过相应抗原预吸收血清消除,从而达到结合物Western blot检测的Anti-PS使用要求。自制3份免疫血清均可用于火箭免疫电泳分析。结论自制的家兔免疫血清可替代商品诊断血清,并达到了ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法群特异性和相应方法专属性要求,可用于对C群脑膜炎球菌结合物制备过程的多糖抗原性分析及结合疫苗质量控制。     

我国ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗趋势分析及质量评价

<正>ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗是我国于21世纪新研制的疫苗,用于预防由相应群脑膜炎球菌引起的疾病[1-2]。我国对疫苗实行批签发监管制度,2007年签发了第1批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗,迄今为止,由2007年的1家企业至今已有5家企业获得了生产文号,共签发近500批制品约4 000万人份。仅2013年,该疫苗批签发85批次,共计7 484 833人份。     

W135群脑膜炎球菌培养基优化

目的试验设计法优化W135群脑膜炎球菌培养基,以期提高荚膜多糖产量。方法配制流脑半综合培养基(1、2、3号)及改良TSB培养基,以W135群脑膜炎球菌为试验菌株,菌密度为响应值,采用全因子试验、最陡爬坡试验、中心组合设计及响应面分析试验对碳氮比进行优化,采用正交试验对硫酸镁、氯化钙、L-胱氨酸、氯化铵、谷氨酸钠、硫酸亚铁6种培养基添加成分进行筛选及优化。结果 1号流脑半综合培养基确定为基础培养基;葡萄糖及酸水解酪蛋白为影响菌密度的主效应因素,两者的最适浓度为7. 84和10. 04 g/L;培养基6种添加成分对W135群脑膜炎球菌生长影响作用大小依次为硫酸镁、L-胱氨酸、硫酸亚铁、氯化铵、氯化钙、谷氨酸钠。优化的1号流脑半综合培养基不仅成分更加简单,且提高了W135群脑膜炎球菌密度。结论优化的培养基增加了W135群脑膜炎球菌密度,为荚膜多糖产量的提高奠定了基础。     

冻干A+C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性和免疫原性

目的观察冻干A+C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性和免疫原性。方法遵循随机、对照、盲法的原则,选择6～9月龄和≥3岁人群,分别接种观察组(冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗)和对照组(6～9月龄:A群脑膜炎球菌多糖疫苗;≥3岁:对照A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗)疫苗,观察接种反应、血清抗体含量及抗体阳转率。结果免疫后6～9月龄观察组和对照组全身反应总发生率分别为1.67%和4.58%,局部反应总发生率分别为0.83%和2.08%;≥3岁观察组和对照组全身反应总发生率分别为2.50%和3.33%,局部反应总发生率均为0.83%。6～9月龄观察组和对照组免后A群抗体含量分别为22.27和3.61μg/ml,抗体阳转率分别为99.01%和66.67%,两组差异有统计学意义(P<0.05);≥3岁观察组A、C群抗体含量分别为21.28和17.94μg/ml,抗体阳转率分别为99.04%和98.08%;≥3岁对照组A、C群抗体含量分别为34.43和22.66μg/ml,抗体阳转率均为98.04%,两组间抗体含量差异有统计学意义(P<0.05),但阳转率差异无统计学意义(P>0.05)。结论冻干A+C群脑膜炎球菌结合疫苗在6～9月龄组与3岁及以上组人群中接种具有良好的安全性和免疫原性。     

毛细管电泳法检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离载体蛋白含量

目的建立毛细管电泳法检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中游离载体蛋白破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)含量,并对方法进行验证及初步应用。方法采用胶束电动毛细管电泳法测定TT含量,使用内径50μm未涂层熔融石英毛细管柱(有效柱长为104 cm),以40 mmol/L硼酸盐-SDS缓冲液(p H 9.30)为电泳介质,电压为30 k V,在200 nm紫外波长条件下进行检测。对方法的专属性、线性、精密度、重复性、稳定性、准确性、定量限进行验证,并用建立的方法检测Y群和W135群脑膜炎球菌结合物原液各3批样品中的游离蛋白TT含量。结果该方法专属性、精密度、重复性、稳定性、准确性良好,TT在10~35μg/ml范围内与色谱峰相对内标峰面积比值呈良好的线性关系,r~2=0.995,游离蛋白的定量限为7μg/ml。用建立的方法检测Y群和W135群脑膜炎球菌结合物原液各3批样品中的游离蛋白TT含量均小于10μg/ml。结论建立的毛细管电泳法操作简便、准确,可用于检测Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合物原液中的游离蛋白含量。     

超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺优化

目的优化超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺。方法以截留分子量为300 000的超滤膜对C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物进行超滤分离,以膜通量和多糖回收率为评价指标,优化方法中的超滤膜材质(300 k Da的聚醚砜膜和再生纤维素复合膜)、透析次数(1~6次)、超滤缓冲液(0.15 mol/L Na Cl、0.5 mol/L Na Cl、50 mmol/L的PBS和H2O)、多糖初始溶解浓度(0.25、0.5和1 mg/m L)和超滤方式(浓缩补液超滤和恒体积超滤)。采用最佳条件对C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物进行检测。结果 C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的最佳超滤条件为:以再生纤维素复合膜为超滤膜,0.15 mol/L Na Cl为超滤缓冲液,透析次数为5次,多糖初始溶解浓度为1.0 mg/m L,超滤方式为浓缩超滤。该方法可有效去除C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物中较大分子量的多糖组分,多糖回收率在80%以上,且可在一定程度上降低多糖水解物的内毒素含量。结论成功优化了超滤法纯化C群脑膜炎球菌荚膜多糖降解物的工艺,显著提高了工作效率。     

2013～2016年A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗质量的一致性分析

目的分析2013~2016年本公司生产的A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗关键质量属性的变化趋势,评价产品质量的一致性。方法根据《中国药典》三部(2010及2015版)规定的方法对2013~2016年本公司生产的520批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量(A群磷含量、C群多糖N-乙酰神经氨酸含量)、水分及多糖分子大小等关键质量指标进行检测,应用Minitab数据分析软件对产品关键质量指标的检测结果进行I-MR控制图趋势比较分析、方差分析及工艺能力指数分析。结果 2013~2016年A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的A群磷含量、C群多糖N-乙酰神经氨酸含量、水分及多糖分子大小的检测结果均在国家标准范围内,整体处于稳定状态。结论 A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产工艺稳定,产品质量一致性良好。     

1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼活化A群脑膜炎球菌多糖制备的结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性

目的分析1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化A群脑膜炎球菌多糖(group A meningococcal polysaccharide,Men APS)制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性及其工艺稳定性。方法用CDAP活化多糖后,己二酰肼(adipic dihydrazide,ADH)衍化,制备多糖-酰肼基衍生物,在碳二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopmpyl)carbodiimide,EDAC]作用下,与TT偶联,制备A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液(Men APSCDAP-TT),考察其免疫特性;将Men A PSCDAP-TT与C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液混合,制备A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCDAP-TT),再与市售的采用溴化氰(CNBr)活化多糖制备的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗(Men ACPSCNBr-TT)进行抗A群多糖Ig G抗体水平的比较。连续制备12批结合疫苗原液及9批结合疫苗,原液参考《中国药典》三部(2010版)进行各项检定,疫苗进行抗A群多糖Ig G抗体水平的检测。结果 Men APSCDAP-TT具有T细胞依赖性抗原特性;Men ACPSCDAP-TT免疫2次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT明显高于市售疫苗免疫2次后水平,差异有统计学意义(P均0.01),也高于或相似于市售疫苗免疫3次后水平,但差异无统计学意义(P均0.05);免疫3次后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT仍高于或相似于市售疫苗,但差异无统计学意义(P0.05)。连续制备的12批结合疫苗原液,内毒素含量均低于10 EU/μg多糖,未检出游离蛋白,多糖/蛋白值、结合多糖含量、结合物分子大小分布、EDAC和ADH残留均符合A群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程(试行)YBS01112006的要求,主要检测指标及多糖回收率趋势分析基本在均数±2标准差内;9批Men ACPSCDAP-TT免疫后产生的抗A群多糖Ig G抗体GMT均在A群脑膜炎球菌多糖的60倍以上。结论经CDAP活化多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的A群脑膜炎球菌结合疫苗具有良好的免疫原性,制备工艺稳定、可靠,为规模化生产奠定了基础。     

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中A群游离多糖含量测定方法的建立

目的建立脑膜炎球菌结合疫苗中A群游离多糖含量的定量检测方法,并进行验证。方法采用高效阴离子色谱-电导法(high-performance anion-exchange chromatography with conductivity detection,HPAEC-CD),分析柱:IonPacTMAS11 Analytical(4 mm×250 mm),22 mmol/L Na OH流洗,流速为1 ml/min,25μl自动进样,电导检测。筛选样品的氧化反应最佳温度、双氧水浓度及干烤时间,确定HPAEC-CD的检测限和定量限,并进行专属性、准确性及精密度验证。应用建立的方法检测3批多糖蛋白结合物原液A-破伤风类毒素(A-tetanus toxoid,A-TT)多糖及游离多糖含量,并与《中国药典》三部(2010版)附录ⅦA磷测定法中的传统比色法进行比较;同时检测3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖及游离多糖含量。结果确定样品的氧化条件为:100μl/ml H2O2,220℃干烤90 min。磷标准品在0.1~1μg/ml范围内,峰面积和浓度线性关系良好(r=0.999 877);TT、C-TT、W-TT及Y-TT对测定无干扰;该方法的检测限为0.007μg/ml,定量限为0.024μg/ml;A群脑膜炎球菌多糖原液的加样回收率在97.56%~102.95%之间;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%。A-TT的多糖含量及游离多糖含量与传统比色法测定结果差异较小;3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖含量均符合《A、C群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》及《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》要求,游离多糖含量分别为24.31%、23.04%、24.44%和19.07%、17.80%、19.46%。结论采用H2O2氧化处理,HPAEC-CD检测,除了能对脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中微量A群多糖含量进行定量检测外,还能够进行游离多糖含量的检测。该方法灵敏度和精密度良好,操作简单、安全,对操作者及环境提供了保护。     

冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗和两种脑膜炎球菌多糖疫苗的渗透压摩尔浓度

目的采用冰点下降法测定乙型脑炎减毒活疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。方法按照《中国药典》三部(2010版)附录渗透压摩尔浓度测定法,采用冰点下降法分别测定市售20批乙型脑炎减毒活疫苗、55批A群脑膜炎球菌多糖疫苗和7批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗及相应稀释剂的渗透压摩尔浓度。结果 3种疫苗之间的渗透压摩尔浓度存在较大的差异,在260~700 m Osmol/kg之间,其中乙型脑炎减毒活疫苗的批间和批次内渗透压摩尔浓度之间的差异较大,A群脑膜炎球菌多糖疫苗和ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗各自的批间和批次内渗透压摩尔浓度差异不大;3种疫苗稀释剂的渗透压摩尔浓度也存在较大差异。结论在上述3种疫苗质量控制体系中应酌情增加渗透压摩尔浓度检查项。     

A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量HPLC检测方法的验证及应用

目的验证A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量的检测方法。方法采用色谱柱XBridge Amide(4. 6 mm×150 cm,3. 5μm),流动相为乙腈、水、三乙胺(75∶25∶0. 1)的混合液,流速为1 mL/min,柱温为40℃,示差检测器温度为40℃,进样量为50μL。同时验证该方法的系统适用性、特异性、线性范围、精密度、稳定性、准确度及定量限。采用该方法对3个厂家生产的30批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量进行检测。结果乳糖对照品色谱峰的理论塔板数为8 123,与其他色谱峰的分离度> 1. 5;乳糖对照品及供试品溶液图谱于相应保留时间处可见乳糖峰,阴性对照溶液未见该色谱峰;乳糖浓度在0. 050 03~0. 650 4 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=3. 484 3×10^5X-7. 378 4×10^2,R^2=0. 999 97。批号为Y201409089-1、Y201501002和201410050的3批供试品溶液分别测定6次结果的RSD分别为0. 71%、1. 01%和1. 69%;分别于12个时间点测定结果的RSD分别为0. 25%、0. 38%和0. 58%;乳糖回收率分别为101. 67%、101. 93%、99. 43%,RSD分别为1. 37%、1. 20%、1. 37%。乳糖定量限为0. 4μg。30批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖含量为8. 29~11. 05 mg/mL。结论该方法具有良好的精密度、稳定性及准确度,可作为A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中乳糖的检测方法。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。