C、Y、W 135群脑膜炎球菌荚膜多糖化学结构核磁共振检测方法的建立

目的建立基于核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术检测C群脑膜炎球菌荚膜多糖(group C meningococcal capsular polysaccharide,GCMP)、Y群脑膜炎球菌荚膜多糖(GYMP)和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖(GWMP)化学结构的方法。方法建立1H-NMR检测方法:使用布鲁克600 MHz超导傅里叶核磁共振谱仪,配置5 mm BBO正向宽带高分辨液体探头。脉冲程序为水峰压制(zgpr),温度为298 K(25℃)。具体参数设置如下:中心频率约为4.7 ppm;图谱宽度为7 211 Hz;采样时间为2.272 s;弛豫延迟时间为2 s;扫描次数为512次;信号经傅里叶转换后加入1.0 Hz的窗口函数,检测结果使用Topspin 3.0软件进行处理。验证该方法的专属性、重复性及中间精密性。结果 5批GCMP、GYMP和GWMP检测结果的CV值均小于0.35%;3个浓度GCMP、GYMP和GWMP在相同的操作条件下以及不同工作日间、不同实验员间的检测结果的CV值均小于0.35%。结论建立的1H-NMR检测方法简便、快速、准确,检测GCMP、GYMP和GWMP具有极高的专属性、重复性和中间精密性,适用于疫苗生产研究中GCMP、GYMP和GWMP样品的定性结构鉴定。     

C群脑膜炎球菌家兔免疫血清的制备及其群特异性和相关方法专属性分析

目的制备C群脑膜炎球菌家兔免疫血清,并进行群特异性和相关方法专属性分析。方法用制备的C群脑膜炎球菌菌液免疫青紫兰家兔,经耳缘静脉注射8×109个/ml菌液,0.5~1.0 ml/只,每周1、3、5免疫,共免疫4周,于第6周开始加强免疫,每周2次,连续3周,于末次免疫1周后,经颈动脉采血,分离血清,采用免疫双扩散法检测血清效价。采用ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法分析其群特异性和相应方法专属性。结果建立了家兔免疫血清制备方法,制备的3份(1、2、3)免疫血清相应多糖抗体效价分别为1︰8、1︰8和1︰16。自制免疫血清1、3在使用工作浓度下,符合免疫学质量控制ELISA方法的特异性和专属性要求。自制免疫血清3可作为C群脑膜炎球菌结合物Western blot检测的Anti-PS血清,在该检测灵敏度下可完全达到与破伤风类毒素(TT)无交叉反应;血清1、2的轻微交叉反应可通过相应抗原预吸收血清消除,从而达到结合物Western blot检测的Anti-PS使用要求。自制3份免疫血清均可用于火箭免疫电泳分析。结论自制的家兔免疫血清可替代商品诊断血清,并达到了ELISA、Western blot及火箭免疫电泳法群特异性和相应方法专属性要求,可用于对C群脑膜炎球菌结合物制备过程的多糖抗原性分析及结合疫苗质量控制。     

人血清中A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖IgG抗体含量ELISA检测方法的建立

目的建立人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖Ig G抗体含量的ELISA定量检测方法,并进行验证。方法筛选适用的酶标板,优化抗原包被浓度,确定ELISA检测过程的关键条件,对建立的ELISA方法的特异性、线性、准确性、精密度、最低检测值和稳定性进行验证,并建立实验室质控血清的质控检测范围。结果酶标板的板内CV为9.8%,板间CV为16.4%,符合检测使用要求。免疫血清经多糖吸收后,群特异性抗体含量与同群多糖吸收剂量呈明显的剂量依赖关系。12份美国CDC质控血清中各群Ig G抗体含量与血清的稀释度呈负相关,相关系数(r)和斜率(slope)均接近-1,线性关系良好;检测结果与CDC公布数据一致性良好,一致性相关系数A、C、W135、Y群分别为0.912 5、0.939 6、0.963 7和0.920 6,准确度较好。实验室内部质控血清Men20中各群Ig G抗体含量试验内和试验间精密度分别小于10%和20%,精密度较好;各血清群别的CV值均30%,稳定性较好;A、C、Y、W135群多糖Ig G抗体含量最低检测值分别为0.092、0.118、0.067和0.035μg/ml,质控血清的检测范围分别为:92.49~36.53、37.29~17.69、66.18~25.54和50.15~23.31μg/ml。结论建立了标准化的检测人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖Ig G抗体含量的定量ELISA方法,并确定了实验室日常用质控血清Men20的质控检测值范围。