人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质及结晶条件的筛选

目的分析人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质,并初步筛选其结晶条件。方法分别采用还原、非还原SDS-PAGE及高效液相体积排阻色谱(size exclusive chromatography-HPLC,SEC-HPLC)法检测抗体纯度;还原SDSPAGE测定抗体轻重链相对分子质量;毛细管电泳测定抗体等电点;高效液相阳离子交换色谱(ion exchange chromatographyHPLC,IEC-HPLC)法检测抗体电荷异质体含量;悬滴气相扩散法初步筛选抗体的结晶条件。结果人源化抗CD20单克隆抗体的非还原SDS-PAGE纯度为100%,还原SDS-PAGE纯度(轻链+重链)为100%,重链、轻链相对分子质量分别为58 000和27 000,SFC-HPLC纯度为99.2%;等电点为9.2;抗体表面电荷分布较均一;得到的蛋白晶体为孪晶,分辨率约为8埃。结论该抗体的纯度达到结晶要求,以其理化性质为基础,初步筛选出了结晶条件,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B亲和层析分离羊抗人IgG的比较

目的比较国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B两种不同介质偶联人免疫球蛋白纯化羊抗人IgG的差别。方法采用亲和层析的方法纯化羊抗人IgG,通过血凝实验检测不同介质纯化产物的效价和特异性。通过SDS-PAGE检测其纯度。通过计算偶联率及蛋白回收率,比较两种介质纯化效率。结果两种不同介质纯化的羊抗人IgG特异性良好,效价均为1∶512,SDS-PAGE检测均为单一条带。采用两种介质纯化羊抗人IgG,蛋白回收率分别为10·03%和17·45%。结论两种不同介质采用亲和层析方法纯化均可获得纯度较高的羊抗人IgG。     

葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000～180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。     

毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性分析

目的对毕赤酵母表达人胰岛素前体的不均一性进行分析。方法应用疏水层析和C18反相制备,对毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体蛋白进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、质谱相对分子质量分析,并进行C-末端和N-末端测序。结果 SDS-PAGE测定为单一条带,SEC-HPLC测定为单一峰,但RP-HPLC检测结果出现2个峰;峰2相对分子质量为5 959,是正常的胰岛素前体,峰1为两种混合物,相对分子质量分别为5 716和5 816,可能是缺少了1~2个氨基酸产物;N-末端分别缺少了1个氨基酸(Phe)和2个氨基酸(Phe-Val),C-末端未发生降解。结论利用毕赤酵母得到的人胰岛素前体存在不均一现象,为胰岛素制备提供了新思路。     

人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立

目的建立人源化抗表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体的质控方法。方法采用体外细胞生长抑制试验测定人源化抗EGFR单抗的生物学活性;质谱法和还原型SDS-PAGE法测定其准确相对分子质量;去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列;SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)法测定其纯度;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定其肽图;定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量;其余项目按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果人源化抗EGFR单抗原液和成品的相对生物学活性分别为(100±20)%和(94±14)%;质谱法测得该单抗参考品轻、重链的相对分子质量分别为23 370.75和50 341.00,相对误差分别为0.005%和0.006%;还原型SDS-PAGE测得该单抗轻、重链的相对分子质量为27 000和53 400;轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致;单抗原液的还原型SDS-PAGE纯度为98.5%;SEC-HPLC原液纯度为(98.39±0.05)%和成品SEC-HPLC纯度为(98.17±0.04)%;肽图图谱与理化参考品一致;定量PCR测得其外源DNA残留量小于100 pg/剂量;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求及其他相关要求。结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制。     

白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化

目的原核分泌性表达白喉毒素无毒突变体H21G蛋白并进行纯化,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定基础。方法以p ET16a-H21G质粒为模板,PCR扩增H21G基因,亚克隆至p ET22b载体中,构建重组原核表达质粒p ET22b-H21G,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组H21G蛋白分泌性表达。重组蛋白经渗透压休克,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6FF(high sub)疏水层析纯化后,使用还原/非还原SDS-PAGE和HPLC法分析纯化蛋白的纯度,窄范围等电聚焦分析其等电点,MALDI-TOF质谱法分析其相对分子质量,N-末端测序法鉴定N-末端氨基酸序列。结果重组原核分泌性表达质粒p ET22b-H21G经双酶切(NcoⅠ和XhoⅠ)和测序证明构建正确;目标蛋白以可溶形式存在于宿主菌周质间隙,表达量为10%~15%;经纯化后,重组蛋白纯度达95%以上,等电点在4.55~6.20之间,相对分子质量和N-末端氨基酸序列均与白喉毒素相符合。结论成功分泌性表达并纯化了重组白喉毒素无毒突变体H21G蛋白,为下一步开发以重组H21G蛋白为基础的疫苗奠定了基础。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

重组人睫状神经营养因子纯化工艺的建立

目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后经Butyl HP疏水层析和Q HP阴离子交换层析进行纯化。通过非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)检测样品纯度;质谱法测定rh CNTF的相对分子质量;Edman化学降解法测定rh CNTF的N-端氨基酸序列;TF-1细胞/CCK-8比色法和对饮食诱导性肥胖(diet-induced obesity,DDIO)大鼠的减肥作用分别测定rh CNTF的体外和体内生物学活性。结果纯化后rh CNTF的纯度可达99.6%,纯化回收率为34.5%;相对分子质量为21 153;N-端15个氨基酸序列为Ala-Phe-Thr-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Thr-Pro-His-Arg-Arg-Asp-Leu;生物学比活性高于2×106 IU/mg,并能有效降低DIO大鼠体重。结论经3步纯化成功获得了高纯度的rh CNTF,为进一步对其性质、功能和生产应用研究奠定了基础。     

重组人白细胞介素-12(CHO细胞)的纯化及其活性

目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

牛乳溶菌酶的原核表达及初步纯化

目的原核表达并初步纯化牛乳溶菌酶(Bos taurus lysozyme1,LYZ1)。方法人工设计并合成LYZ1基因CDS序列,将其克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-LYZ1,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果所构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确;SDS-PAGE分析显示,目的蛋白相对分子质量约为32000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的70%以上,切胶纯化后纯度达95%;Western blot分析显示,重组融合蛋白可与小鼠Anti-HisTag单抗特异结合。结论已成功原核表达并初步纯化了LYZ1,为后续研究与应用奠定了基础。     

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。     

蜂毒明肽的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。     

人鼻病毒3C蛋白酶基因的克隆、表达、纯化及活性

目的获得重组3C蛋白酶,开发一种新型的基因工程工具酶。方法通过RT-PCR方法获得人鼻病毒3C蛋白酶基因,克隆入表达载体pBV220,构建非融合表达载体pBV220-3C,转化大肠杆菌BL21(Gold)进行表达。表达产物经变性阳离子交换层析纯化后复性,再经Superdex-75凝胶过滤进一步纯化,获得的3C蛋白酶在4℃条件下,酶切融合蛋白IL-11,进行活性测定。结果3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定、高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在。经过纯化、复性,纯度达90%以上,获得的3C蛋白酶能够有效切割含3C酶切位点的融合蛋白。结论已成功开发了一种新型的基因工程工具酶。     

幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

重组人源化抗程序性死亡受体-1单克隆抗体关键质控方法的建立

目的建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法。方法经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原/非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性。结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8%、98.1%和97.9%,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7%、95.4%和95.5%;单体含量分别为99.3%、99.1%和99.4%,聚体含量为0.5%、0.6%和0.4%;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8%、21.4%和21.6%,主峰含量分别为58.4%、58.6%和58.7%,碱性区含量分别为19.8%、20.0%和19.7%;相对生物学活性分别为112%、98%和102%。结论本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法 rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果 Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95. 40%、95. 90%和99. 19%,宿主蛋白残留量分别为2 500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0. 56和0. 12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24. 5、3. 2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97 300,等电点范围为5. 5~6. 5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。