烟草灰霉病菌嘧菌酯抗药性突变菌株的诱导及其生物学习性分析

  目的  为了解烟草灰霉病菌对嘧菌酯潜在的抗药性风险。  方法  通过紫外诱变诱导烟草灰霉病菌对嘧菌酯的抗药性突变菌株,分析其对嘧菌酯的敏感性和生物学习性。  结果  嘧菌酯对烟草灰霉病菌分生孢子萌发具有较高的抑制作用,其抑制孢子萌发的EC₅₀为2.28 mg/L。紫外诱变获得5株不同抗性水平的嘧菌酯抗药性突变菌株,对嘧菌酯抗性是诱变前菌株的1.69~10.41倍。继代培养11代后,各突变菌株对嘧菌酯的敏感性稳定;突变菌株菌丝生长速度高于或低于初始菌株;所有突变菌株的分生孢子产量和萌发率均低于初始菌株;突变菌株菌核产量同初始菌株一致或有所降低;所有突变菌株具有致病力,部分致病力强于初始菌株。  结论  嘧菌酯对烟草灰霉病菌分生孢子萌发具有较强的抑制作用;若使用嘧菌酯防治烟草灰霉病,存在烟草灰霉病菌对嘧菌酯产生抗药性的风险。      

烟草赤星病菌对嘧菌酯及其添加水杨肟酸后的敏感性检测

为了解烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性现状,采用菌丝生长速率法,检测了采自山东和湖北烟区的33株烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性,分析了水杨肟酸协同下烟草赤星病菌对嘧菌酯敏感性的影响。结果表明:嘧菌酯对所有供试烟草赤星病菌的EC₅₀介于60.5230~111.7918 mg·L-1,平均为83.9068±2.4339 mg·L-1;嘧菌酯对采自山东烟区和湖北烟区的赤星病菌的平均EC₅₀分别为82.7986±2.5515 mg·L-1和88.0230±6.6785 mg·L-1。在水杨肟酸协同作用下,嘧菌酯对所有供试烟草赤星病菌毒力的EC₅₀介于19.9090~35.6684 mg·L-1,平均为29.2007±0.7801 mg·L-1,比嘧菌酯单独作用毒力提高了0.70~2.98倍,平均提高了1.87倍;添加水杨肟酸的嘧菌酯对采自山东和湖北烟区的赤星病菌毒力的平均EC₅₀分别为28.5494±0.8914 mg·L-1和31.6197±1.3290 mg·L-1,与嘧菌酯单独作用相比,毒力分别提高了1.90和1.78倍。研究表明,嘧菌酯对烟草赤星病菌的菌丝生长具有一定的抑制作用,添加水杨肟酸能够显著提高嘧菌酯对烟草赤星病菌的毒力,但不同菌株之间的提高倍数有差异。      

线粒体旁路氧化途径抑制剂水杨肟酸(SHAM)协同下烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性

测定了线粒体旁路氧化途径抑制剂水杨肟酸(SHAM)协同下烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性。结果表明:嘧菌酯抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发的EC₅₀值分别为25.8300 mg/L和0.0500 mg/L,在100 mg/L SHAM协同下,EC₅₀值分别降低为15.5200和0.0038 mg/L;SHAM对烟草赤星病菌菌丝的生长和分生孢子的萌发没有影响。研究说明SHAM增强了嘧菌酯对烟草赤星病菌的毒力,线粒体电子传递的旁路氧化途径存在于烟草赤星病菌中,且在孢子萌发中的增效强于菌丝生长阶段。      

烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗药性检测

为了解吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗性水平,采用菌丝生长速率法,测定了318株烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的药剂敏感性,建立敏感基线。运用最低抑制浓度法确定抗性菌株及频率,并比较不同采样地点的抗性水平。结果表明,供试敏感菌株对菌核净的敏感性频率分布呈连续的单峰曲线,接近正态分布,其EC₅₀均值2.916 μg/mL可作为两省烟草赤星病菌对菌核净的敏感基线,抗性频率为21.38%;烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的敏感基线为1.198 μg/mL,抗性频率为18.24%。吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑产生了不同程度的抗性,不同地点抗性水平存在差异。本研究为烟草赤星病菌的抗药风险评估奠定了基础,为制定吉林和黑龙江两省烟草赤星病科学防治策略和科学用药提供了依据。     

油菜菌核病菌对腐霉利的抗性诱变及抗药菌株的生物学特性

从江苏省镇江市和扬州市采集菌核病植株的茎,从中分离获得油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）单菌核菌株。32个野生型菌株药剂敏感性（EC50）频率分布数据显示,病菌对腐霉利的敏感基线EC50值为0．1981±0．0220μg／mL,MIC（最小抑菌浓度）值为1．1±0．1595μg／mL。实验未发现田间抗腐霉利菌株。通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利突变体（EC50〉1000μg／mL）。这些抗性突变株经转管培养5～20代后抗药性稳定。它们对同类药剂异菌脲和有机磷类甲基立枯磷也表现高抗,但对苯并咪唑类多菌灵敏感。与野生型敏感菌株相比,抗腐霉利突变株菌丝生长较慢,对油菜茎秆和叶片的致病力均较弱。     

非病原细菌对烟草赤星病菌的生物抑制作用研究

从烟草根际土壤和烟草、黄瓜、番茄、桑树的茎、叶部位分离了５０株非病原芽孢杆菌和假单孢杆菌,在培养条件下对烟草赤星病菌进行了生物拮抗性测定。结果表明,非病原细菌对烟草赤星病菌有效强的拮抗作用。在不同来源的非病原细菌中,以来自烟草根际的非病原细菌对烟草赤星病菌的拮抗作用最强。在拮抗菌对目标菌烟草赤星病菌生长发育影响中发展,受拮抗菌作用,目标菌菌丝形态产生变异,生长发育受到影响。选取拮抗性较强的拮抗菌,在温室条件下处理（喷洒）烟苗,结果对烟草赤星病具有明显的抑制作用。     

烟草赤星病防治药剂的筛选

为筛选防治烟草赤星病的高效杀菌剂,测定了5种常用药剂(氟啶胺、啶氧菌酯、啶酰菌胺、嘧菌环胺、噁唑菌酮)对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的室内毒力及田间防效。结果表明,98%氟啶胺对病菌菌丝生长的抑制活性最强,EC_(50)为0.138 2 mg/L,其次为95%嘧菌环胺,EC_(50)为3.568 9 mg/L,而95%噁唑菌酮最弱,EC_(50)为30.098 3 mg/L。田间防效试验表明,5种杀菌剂中以50%氟啶胺SC和62%嘧菌环胺WG的防治效果较好,防效分别为70.44%和63.09%;以50%啶酰菌胺WG防治效果最差,为39.53%。综合室内毒力和田间防治试验结果,在烟草赤星病防治中推荐氟啶胺和嘧菌环胺。     

不同类型杀菌剂对烟草黑胫病菌生物活性的研究

研究了烯酰吗啉、嘧菌酯、醚菌酯、甲霜灵及代森锰锌5种不同类型杀卵菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊产量、游动孢子释放、孢子囊直接萌发及休止孢萌发的生物活性。结果表明:烯酰吗啉和甲霜灵对菌丝生长具有强烈的抑制作用,其次为代森锰锌,嘧菌酯和醚菌酯的活性最低;烯酰吗啉和甲霜灵对孢子囊的形成也具有很高的抑制活性,显著高于其它类药剂;游动孢子的释放对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为代森锰锌,而烯酰吗啉和甲霜灵对其没有抑制作用;孢子囊的直接萌发对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为烯酰吗啉和代森锰锌,而甲霜灵对此阶段没有活性;休止孢的萌发对嘧菌酯和醚菌酯最为敏感,其次为烯酰吗啉、代森锰锌,而甲霜灵不影响其萌发。     

油菜菌核病菌对嘧菌环胺和不同杀菌剂敏感性的相关分析

为了明确油菜菌核病菌对新型杀菌剂嘧菌环胺的敏感性和该药剂与其它杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定江苏省不同地区的53个油菜菌核病菌菌株对嘧菌环胺的敏感性,并测定对嘧菌环胺不同敏感性的10个菌株对菌核净、异菌脲、腐霉利、多菌灵、咪鲜胺和戊唑醇等杀菌剂的敏感性。结果表明,菌株间对嘧菌环胺的敏感性差异显著,EC50（抑制中浓度）值在0.0342～1.087 6μg/mL之间;通过EC50值相关性分析,油菜菌核病菌对嘧菌环胺与上述杀菌剂之间不存在交互抗性。     

油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗药机制初步分析

通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利油菜菌核病菌（Sclerotiniasclerotiorum）突变体。与野生亲本菌株相比,抗性突变株（EC50〉800μg/mL）在高糖（〉40g/L蔗糖）和高盐（〉5g/LNaCl）培养基上生长缓慢,表明对高渗透压比较敏感;菌丝相对电导率较高,显示细胞膜透性增大,胞内电解质渗出较多。试验还发现,在含药培养液中,亲本菌株菌丝内甘油大量合成和积累,增加462.45%,而抗药突变株甘油含量仅稍有增加或有所下降,说明抗腐霉利突变株对外界渗透压的调节能力较低。根据已报道组氨酸激酶（HK）基因序列设计特异引物,经PCR扩增和测序,获得油菜菌核病菌HK基因保守区域序列1605bp。抗、感腐霉利菌株HK基因保守区域在第45位、第81位和第625位碱基不同,但编码的氨基酸一致。因此,油菜菌核病菌对腐霉利的抗性及抗药菌株的高渗敏感性与HK基因保守区域碱基突变无关。     

木霉拮抗烟草赤星病菌菌株的筛选及拮抗机制

利用诱捕法从土壤中分离得到18株木霉(Trichoderma sps.)菌株,采用对峙法从中测定、筛选出一株对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)具有极强拮抗作用的菌株(Tv-1).光学显微镜及透射电镜观察结果表明,Tv-1菌株的拮抗机制主要为生长竞争、寄生作用以及产生抗菌素类物质使病菌菌丝消解,表现为Tv-1菌株菌丝生长迅速;能附着、缠绕于病菌菌丝上,并产生吸器侵入菌丝;同时还能分泌使病菌菌丝原生质浓缩、断裂、消解的物质.     

安徽烟草赤星病菌生物学特性及致病力分化研究

研究了安徽地区烟草赤星病菌的生物学特性和致病力分化,结果表明,该菌在10～35℃条件下均能生长,最适生长温度为25～30℃,温度低于7℃或高于40℃菌丝不能生长;分生孢子致死温度是53℃5 min和50℃10 min,幼菌丝致死温度是52℃5min和49℃10 min.病菌在pH 4.0～11.0的范围内均能牛长,呈现双峰曲线,即在pH 6.0～pH 8.0生长较快,尤以pH 6.0和pH 8.0的条件下菌丝生长更快;分生孢子在pH 4.0～11.0之间均可以萌发;在pH 6.0时,产孢量最高.在光照和黑暗交替的条件下,有利于菌丝的生长和孢子产生.致病力测定结果表明,不同菌株之间致病力存在显著差异,根据接种K326烟草后所致病情指数的大小可供试菌株致病力划分为致病力强、中等、弱和不致病4种类型,说明安徽烟草赤星病菌存在明显的致病力分化;在不同烟区间和同一烟区内均存在不同致病力类型的菌株,致病力类型的分布与菌株地区来源有一定的相关.     

烟草叶围细菌的分离及其对Alternaria alternata的拮抗作用

分离到烟草叶围细菌136株,通过对峙培养实验筛选出对烟草赤星病菌A.alternata有较强拮抗活性的9个菌株.离体叶片生防测定实验表明,9株细菌均能不同程度地减轻烟草赤星病的发生.其中菌株Tpb88具有较强和稳定的拮抗作用,无菌滤液实验表明,叶围细菌Tpb88在一定浓度范围内能有效抑制A.alternata菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长,且浓度越高,抑制能力越强,结果表明Tpb88对烟草赤星病菌的拮抗机制可能为抗菌物质的产生.     

田间烟草赤星病菌繁殖代数与其对杀菌剂敏感性的关系

为合理用药、提高防效,探讨了田间烟草赤星病菌繁殖代数与其对杀菌剂敏感性的关系。室内进行了在田间烟草不同生长时期采集的6个赤星病菌株对杀菌剂敏感性测定,并用聚类分析方法比较了各菌株对杀菌剂敏感性差异。结果表明,不同时期采集的不同繁殖代数烟草赤星病菌株对"菌核净"的敏感性差异显著,其中4号菌株对"菌核净"最不敏感,EC50为193 3644mg/L,已产生一定的抗药性,其次为1号菌株,EC50为102 3738mg/L,对"菌核净"最敏感的是2号和3号菌株,EC50分别为42 0390和58 4109mg/L。表明不论前期还是后期采集的菌株都有对"菌核净"敏感和不敏感的,烟草赤星病菌株的繁殖代数与其对"菌核净"的敏感性无一定规律性。从聚类分析树状图也可以看出这种敏感性的差异情况。     

抗烟草赤星病芽孢杆菌B102菌株的筛选及抑菌作用

从山东烟田烟草根际和根围土壤中分离到157株细菌,筛选出对烟草赤星病菌Alternaria alternata有明显抑菌作用的细菌菌株7个.其中B102菌株对烟草赤星病菌抑菌作用明显,抑菌带宽度达13.0 mm.采用异步培养、对峙培养、含细菌培养等方法,测定发酵滤液及代谢产物对病原菌的作用机制.结果表明,B102菌株对病原菌的抑制作用主要依赖于其产生的抗高温的代谢产物,可抑制病菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝细胞破裂、内含物外泄,致使病菌丧失侵染能力.B102菌株代谢产物经高温及不同的pH值条件处理后仍表现出较高的抑菌活性,表明B102菌株对外界环境条件的稳定性强.     

重庆烟草主要病害土壤拮抗细菌的筛选

从重庆市石柱、黔江、奉节等烟区的烟草根围土壤中采集土样85份,分离获得两类细菌752株.其中芽孢杆菌499株,荧光假单胞杆菌253株.对烟草赤星病菌和黑胫病菌采用对峙培养法,对烟草青枯病菌采用平板喷雾法共初筛到有拮抗活性的菌株348个,占分离株总数的46.3%.复筛结果表明:赤星茵抑茵带宽在8.0～12.0 mm的拮抗菌株有29株,其中芽孢菌12株,荧光茵17株;黑胫菌抑茵带宽在9.0～14.0 mm的拮抗菌株有26株,其中芽孢菌2株,荧光菌24株;青枯茵抑茵圈直径在30.0～42.0 mm的拮抗菌株有31株,其中芽孢菌9株,荧光菌22株.     

烟草赤星病室内防治药剂筛选及田间防治效果

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,测定了10种杀菌剂对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑菌效果,采用田间小区试验对活性较好的4种杀菌剂进行防治效果比较。10种农药室内毒力试验结果显示,10%苯醚甲环唑水分散粒剂、10%多抗霉素可湿性粉剂、50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂、32.5%苯醚甲环唑·嘧菌酯悬浮剂、30%苯醚甲环唑·丙环唑悬浮剂和30%肟菌酯·戊唑醇悬浮剂抑制菌丝生长和孢子萌发的效果好;430 g/L戊唑醇悬浮剂抑制孢子萌发单一效果好;40%腈菌唑可湿性粉剂、40%菌核净可湿性粉剂和6%嘧肽霉素水剂对菌丝生长和孢子萌发的抑制效果都差。4种农药田间试验表明,10%苯醚甲环唑水分散粒剂、30%肟菌酯·戊唑醇悬浮剂、30%苯醚甲环唑·丙环唑悬浮剂和32.5%苯醚甲环唑·嘧菌酯悬浮剂对烟草赤星病的防效分别为90.60%、88.21%、87.21%和83.84%,均表现出良好的效果,推荐使用此4种杀菌剂用于生产上烟草赤星病的防控。     

抗二氯喹啉酸烟草材料的筛选与鉴定

为获得抗二氯喹啉酸的烟草育种材料,本研究通过叶面喷施不同浓度二氯喹啉酸,研究受药害烟株叶面积变化规律和烟草药害等级情况,确定喷施二氯喹啉酸对烟草苗期药害的临界浓度及适宜观测时间,并对烟草EMS突变体材料进行规模化筛选鉴定。结果表明,喷施处理引起烟草药害的临界浓度为0.5 mg/L,超出临界值浓度,烟草叶片会出现明显药害症状;为获得较高抗性的突变体材料,以1 mg/L为最适施药浓度,在药害症状明显时（施药后14 d）进行观测,获得了多个对二氯喹啉酸高抗、中抗及敏感的突变体材料。对高抗材料QR-19的杂交一代株系抗性分析显示,该材料对二氯喹啉酸的抗性可能受隐性基因控制。本研究为解析烟草对二氯喹啉酸等激素型除草剂的抗药性机理及除草剂抗性育种奠定了材料基础。     

荧光假单胞杆菌G20-9拮抗烟草赤星病菌研究

在室内测定了荧光假单胞杆菌菌株G20-9对烟草赤星病菌的拮抗作用.结果表明,G20-9菌株的无菌发酵液对烟草赤星病菌丝生长量有较强抑制作用,抑制效果为82.1%,稀释2倍的无菌发酵液对茵丝生长的抑制效果优于化学杀茵剂菌核净.应用双抗标记法测定了G20-9菌株在烟草叶面和根际的定殖情况,结果表明,该菌可以在烟草叶面和根际定殖.     

烟草几种重要病害拮抗菌的筛选

从山东滕州,临沂等县（市）的烟草,番茄和辣椒根际采集土壤样本１５份,经内分离纯化获得细菌１０２株,放线菌５５株。以烟草赤星病菌,野火病菌和青枯病菌等为力,对１５７个菌株进行平板对峙培养法抑菌测定,分别筛选出和对１种病原真菌和病原细菌有拮抗活性的细菌３３株和放线菌２２株。