转基因大豆Roundup Ready调控元件在食品加工过程中降解变化的研究

35S启动子可能会通过基因的水平转移插入到某一致癌基因上游，活化并导致癌症的发生。为了解转基因植物中调控元件的安全性问题，以转基因大豆Roundup Ready为实验材料，针对Roundup reaqdy转基因大豆中CaMV35S启动子及NOS终止子的序列，设计了不同长度片段的引物，通过对CaMV35S启动子和NOS终止子的PCR扩增，研究了豆腐、豆奶、豆粉3种大豆加工食品中磨浆、煮浆、调配、均质、杀菌、喷雾干燥等关键工艺对Roundup Reaqly大豆中调控元件的影响。结果表明调控原件在食品加工过程中的降解变化与其所处位置有较大关系。扩增长度相近的2个片段，包含大豆基因组。DNA序列的片段受加工过程的影响较小，在3种豆制品的所有加工过程中均能检测到。而只包含CaMV35S启动子序列的片段仅能在原料中检测到，原料经过磨浆后。片段大小降至200bp以下。NOS终止子受食品加工工艺的破坏和影响较小，在被检测食品的每一个加工过程中都能够检测到NOS终止子片段。     

PCR方法检测食品中的转基因成分35S和NOS的研究

根据转基因农作物中最常用的花椰菜叶病毒启动子（CaMV358）和根癌农杆菌终止子（NOS）的序列，设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针（FDCP），分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。利用该套方法对冷冻马铃薯条、大豆、冷冻玉米棒、甜椒、番茄等实物样品进行了检测，发现11份样品中有5份检出35S启动子、NOS终止子，6份样品结果为阴性。结果表明我们建立的两种PCR方法均能有效检测出35S和NOS片段，其中常规PCR方法具有灵敏度高、特性异好的特点；应用FDCP的新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确，有很好的应用前景和研究价值。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳在转基因大豆检测中的应用

利用PCR技术，对转基因大豆中CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-EPSPS和大豆凝集素基因进行了定性检测，并且以大豆凝集素基因为内置标准检测了CaMV35S启动子。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，并对两种电泳进行了比较。聚丙烯酰胺凝胶电泳有利于提高定性PCR筛选方法的准确性。     

棉籽壳培养基及栽培银耳中转基因成分的PCR分析

通过定性PCR技术,对棉籽壳培养基及栽培银耳中的转基因成分进行检测。以棉籽壳培养基及栽培银耳的DNA为模板,设置棉花内源基因Sad1内参对照、转基因棉籽壳阳性对照、非转基因棉籽壳阴性对照和无菌双蒸水空白对照,利用不同的引物分别对CaMV35S启动子、NOS终止子以及Cry1A抗虫基因的特异片段进行PCR扩增及电泳检测。在棉籽壳培养基中可检测出35S、NOS及Cry1A的特异片段,而在棉籽壳栽培的银耳中仅检测出35S和NOS的特异片段,未检出Cry1A的特异片段。研究结果表明,棉籽壳培养基中含有外源转基因成分,并向银耳发生水平转移,而其外源抗虫基因可能未转入银耳中。对棉籽壳栽培银耳中基因水平转移的影响因素和潜在生物安全性进行了讨论。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。     

转基因玉米的七重PCR鉴定方法

以玉米内源基因IVR、外源抗除草剂基因(BAR、PAT)、抗虫基因Cry1Ab、筛选基因NPTII、CaMV35S启动子和NOS终止子为检测的目的片段,分别设计了7对引物,通过研究较佳引物终浓度配比和退火温度,建立了玉米转基因成分七重PCR检测体系。结果表明,建立的七重PCR体系用于同时检测内源基因和转基因成分是可行的,检测方法效率高、稳定性好。     

转基因"华番一号"番茄的筛选和特异性的定性、定量PCR检测方法

为给转基因植物监测提供技术支持，建立了转基因“华番一号”番茄筛选和特异性的定性、定量PCR检测方法。转基因“华番一号”的筛选PCR检测主要以转基因通用元件CaMV35S启动子和NOS终止子为目的基因片段，特异性PCR检测以转基因外源重组子的CaMV35S启动子和反义EFE基因的相邻序列为目的片段；实验同时设立番茄的LAT52基因为转基因番茄定性、定量PCR检测的内对照基因。在所建立的PCR检测体系中，定性PCR筛选和特异性检测的检测极限为68个拷贝，实时定量PCR方法的检测极限为3个拷贝；筛选定量．PCR检测的定量极限为3个拷贝，特异性定量PCR检测的定量极限为25个拷贝。最后通过对2个已知含量的转基因番茄“华番一号”混合试样的检测，证明了该体系可以有效地用于转基因番茄“华番一号”的筛选和特异性的定性、定量PCR检测。     

应用单管半巢式PCR技术筛查转基因食品

建立转基因作物中常见的两种外源调控元件的单管半巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）测方法,为转基因食品的筛选检测提供一种快速、精确的方法。针对6 种转基因作物中CaMV35S启动子和NOS终止子的一致性核苷酸序列,分别设计巢式PCR的内、外引物,在测试不同引物组合的扩增效率基础上,建立CaMV35S启动子和NOS终止子的单管半巢式PCR方法。结果表明,上述方法对两种转基因成分具有良好的特异性,检测灵敏度分别为0.01%和0.05%,显著优于常规PCR方法。该方法具有便捷、准确、灵敏等特点,适合筛查食品中的转基因成分。     

豆腐中转基因大豆成分的检测

目的探索适合豆腐样品的DNA抽提方法并采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术对豆腐试样中的转基因大豆成分进行检测。方法分别采用CTAB和SDS配制抽提缓冲液提取18个豆腐样品中的DNA,针对转基因大豆都含有大豆内源基因lectin及共同元件CaMV35S启动子、nos终止子及epsps基因进行实时荧光PCR扩增。结果 SDS法比CTAB法提取的豆腐DNA质量更好;18个豆腐样品均检测到了lectin,其中有2个样品检测到了CaMV35S启动子的荧光信号,4个样品检测到了nos终止子的荧光信号,所有样品均未扩增出epsps基因。结论 SDS法比CTAB法更适合于抽提豆腐样品的DNA,提取到的DNA可用于实时荧光PCR法检测豆腐内源基因和外源基因。     

多重PCR方法检测食品中转基因成分

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 3 5S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列 ,设计合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 (FDCP) ,分别建立了多重PCR、应用FDCP的实时荧光PCR同时检测转基因成分 3 5S启动子和NOS终止子的方法 .并利用该套方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 1 3份样品中有 6份检出3 5S启动子、NOS终止子 ,其余 7份样品的检测结果为阴性 .表明作者建立的多重PCR方法能有效检测出 3 5S和NOS成分 ,其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点 ,多重荧光PCR法则更为简便、快速、准确     

Detection and identification of genetically modified EE‐1 brinjal (Solanum melongena) by single,multiplex and SYBR® real‐time PCR

BACKGROUND: Brinjal is an important vegetable crop. Major crop loss of brinjal is due to insect attack. Insect‐resistant EE‐1 brinjal has been developed and is awaiting approval for commercial release. Consumer health concerns and implementation of international labelling legislation demand reliable analytical detection methods for genetically modified (GM) varieties. RESULTS: End‐point and real‐time polymerase chain reaction (PCR) methods were used to detect EE‐1 brinjal. In end‐point PCR, primer pairs specific to 35S CaMV promoter, NOS terminator and nptII gene common to other GM crops were used. Based on the revealed 3′ transgene integration sequence, primers specific for the event EE‐1 brinjal were designed. These primers were used for end‐point single, multiplex and SYBR‐based real‐time PCR. End‐point single PCR showed that the designed primers were highly specific to event EE‐1 with a sensitivity of 20 pg of genomic DNA, corresponding to 20 copies of haploid EE‐1 brinjal genomic DNA. The limits of detection and quantification for SYBR‐based real‐time PCR assay were 10 and 100 copies respectively. CONCLUSION: The prior development of detection methods for this important vegetable crop will facilitate compliance with any forthcoming labelling regulations. Copyright © 2012 Society of Chemical Industry     

利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米

应用实时荧光PCR技术对转基因大米进行了定性和定量检测研究.本研究以转基因B163大米为材料,采用TaqMan探针技术,对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthndngiemis,简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因Cry1Ac进行了实时荧光PCR研究,并对外源基因Cry1Ac进行了定量检测和敏感性分析.该实时荧光PCR方法检测结果和常规PCR结果一致,同时不用进行凝胶电泳,更为快速、简便,降低了污染机会,可用于转Bt基因大米的定性和定量检测.     

Development of a quadruplex-real-time-PCR for screening food for genetically modified organisms

With the ever increasing number of genetically modified plants authorized worldwide, including in the European Union, high throughput detection methods need to be developed. In this paper, a quadruplex-real-time-PCR method is described which allows rapid and simultaneous screening of food for the presence of target DNA sequences from the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the NOS terminator from Agrobacterium tumefaciens, the soya reference lectin gene and the maize reference alcool dehydrogenase gene (adh). Three of the four primers and probe combinations have already been published elsewhere, whereas primers and probe for NOS terminator-PCR were developed in-house. Validation data show sensitivities down to five copies for 35S promoter and NOS terminator PCR, even when target sequences of the competing PCRs are in large excess. Thorough adjustment of primer and probe concentrations allowed high individual PCR efficiencies with negligible physical cross-talk between the four detection channels. This method provides a basis for a rapid screening of food for the most frequently used regulatory elements present in GM crops authorized for food in the European Union. In addition it provides information about the presence of species which are possibly genetically modified.     

转基因大豆DNA检测芯片的研究

为提高对转基因大豆的监督检测能力，研制了转基因大豆DNA检测芯片。根据转基因大豆(Roundup Ready)中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、NOS终止子、NOSIEPSPE基因和内源Lectin基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIGdUTP标记杂交探针，并制备基因芯片。在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试。结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．5％，由于采用了多重PCR技术，一次可同时检测多个基因，提高了检测的准确性和效率。