定点突变提高食品新型L-天冬酰胺酶的活力及热稳定性

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase II,EC 3.5.1.1）可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸,减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成,因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注,但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性,对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变,并在Bacilus subtilis 168 中进行表达,提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%,突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%,突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴,提高了其在食品工业中的应用前景。     

基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)广泛应用于食品、纺织等领域。为提高TGase的热稳定性,通过PoPMuSiC-2.1预测了降低Streptomyces hygroscopicus TGase分子折叠能的氨基酸位点,并构建了相应的突变体。PoPMuSiC-2.1预测结果显示,替换P132的氨基酸引起TGase折叠自由能下降的幅度最大。基于此,通过定点突变分别构建了低折叠自由能的突变体P132I、P132G、P132M、P132Q。酶学分析表明,P132I在50℃下的半衰期达到5.0 min,较野生酶提高31%;其它突变体则较野生酶提高2%～13.7%。此外,P132I和P132G比酶活亦分别较野生酶提高24%和12.4%,其它突变比酶活变化不明显。作用力分析发现,突变体P132I中较野生TGase增加两个氢键。上述结果表明,基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变能有效地提高TGase的热稳定性与催化活性,氢键的增加可能是P132I热稳定性提高的原因之一。     

饱和突变提高肌酸酶热稳定性

为提高肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE)的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、 230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高131%、 218%、 83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、 K195T、 K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。     

定点突变提高碱性果胶酶热稳定性

碱性果胶酶(PGL,E.C.4.2.2.2)是一种重要的工业酶,在碱性条件下催化聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。为提高酶热稳定性,将Bacillus sp.WSHB04-02 PGL与3种耐热酶进行氨基酸序列比对,确定7个在耐热酶中保守但在PGL中不保守的位点(158、N189、G191、S229、K314、S315和I325)作为改造的目标位点,单独突变为耐热酶中的保守氨基酸。酶学性质分析显示,PGL突变体热稳定性均有提高。与野生酶相比,N189E、S229K和I325F的55℃半衰期分别提高2.32倍、2.11倍和1.89倍;I58V和K314M 55℃半衰期分别提高19.4%和38.9%,比酶活分别提高65%和91%。结构分析显示,除S315G外的PGL突变体的分子内的多种作用力数量均发生改变。上述结果表明,定点突变能有效提高PGL热稳定性,分子间作用力的变化可能是酶学性质变化的重要原因之一。     

定点突变提高过氧化氢酶热稳定性和催化效率

过氧化氢酶催化过氧化氢分解形成水和氧,主要作用是保护细胞免受活性氧(ROS)的损伤,尽管其在工业上被广泛使用,但因热稳定的不足限制了它的使用前景。本研究以Bacillus pumilus ML413来源的血红素过氧化氢酶(Kat X2)为研究对象,采用定点突变技术提高其热稳定性及催化效率。利用Po PMu Si C algorithm软件计算并预测了其潜在突变位点的折叠自由能,根据预测的结果,选择了其中自由能最低的3个位点(K117V, K117I和K117M)进行突变。结果发现,对K117位点进行突变,可以有效提高Kat X2的热稳定性,突变体K117V在60℃下半衰期比野生型Kat X2提高38 min,催化效率较突变前提高31.7%。根据结构分析发现,该点突变并未改变Kat X2的二级结构。突变体K117V具有良好的工业应用潜力。     

突变酶Y93S对嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶热稳定性的影响

为提高嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对其结构的分析,构建了Y93S突变体,利用分子动力学模拟分析评估后,发现Y93S突变体可能具有较高的耐热能力,利用定点突变技术构建Y93S表达载体并分析温度对表达产物酶活的影响。试验结果表明,突变酶Y93S的最适温度由野生型酶的55 ℃提高至70 ℃;在90 ℃条件下,突变酶Y93S较野生型酶的半衰期由60 min提高到120 min以上;pH及pH稳定性较野生型变化不明显。突变酶Y93S极大的提高了野生型酶的热稳定性,具有潜在的工业应用价值,同时为葡聚糖酶的耐热机理提供有力依据。     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

Lys490饱和突变提高海藻糖合酶转化率的研究

分析预测海藻糖合酶的空间结构,并进行分子对接和序列比对,选择Lys490位点进行定点饱和突变。利用全质粒PCR方法构建饱和突变体库,并利用高效液相色谱法筛选优势突变。经过筛选获得优势突变体K490L、K490I,对比分析表明,突变体K490L、K490I的转化率较原始酶分别提高了18%和15%。突变体酶学性质分析表明,K490L、K490I的最适反应温度及最适pH与原始酶保持一致,皆为25℃和pH 8.0,但两种突变酶的耐热性及耐酸性较原始酶有明显增强。在pH 7.0环境下,突变体K490L、K490I放置60 min后,剩余酶活力均达80%以上,而原始酶低于68%。     

成团泛菌苯丙氨酸氨基变位酶的热稳定性改造

来源于原核生物成团泛菌(Pantoea agglomerans)的苯丙氨酸氨基变位酶(Pa PAM)可催化α-苯丙氨酸转变为药用价值更高的(S)-β-苯丙氨酸,然而其酶活较低,热稳定性较差,限制其工业应用。本研究突变苯丙氨酸氨基变位酶酶活中心上方loop环上的氨基酸及与其相互作用位点的氨基酸,降低loop环的柔性,以期稳定酶活中心的结构,提高酶的热稳定性。筛选得到热稳定性显著提高的突变体I91M,50℃保温1 h后,剩余酶活达到83%(野生型酶酶活仅剩余30%左右)。该结果有助于苯丙氨酸氨基变位酶的理论研究和工业应用。     

基于热不稳定区段分析和二硫键预测的玉米赤霉烯酮脱毒酶ZLHY-6热稳定性改造

目的 脱毒酶ZLHY-6的热稳定性较低, 严重制约了其在食品和饲料工业上的应用, 所以期望通过定点突变改造提高ZLHY-6的热稳定性。方法 本研究基于分子动力学模拟, 设计了两个策略以提高热稳定性。策略一: 寻找ZLHY-6热不稳定区段, 对区段内氨基酸进行计算机虚拟饱和突变, 根据突变自由能变(ΔG)筛选结果选取了10个突变体。策略二: 通过预测, 在ZLHY-6分子内引入二硫键, 每个突变体引入1对, 共计5个突变体。结果 突变体H134W和Q45C/A253C在45℃ 热处理20 min后, 其相对酶活分别为野生型的10倍和3.1倍, 并保留了对ZEN一定的活性(41.33%、102.67%)。通过分子动力学分析和结构模拟发现, 突变的引入可能削弱了构象的波动性, 提升了结构刚性, 从而提升了蛋白的热稳定性。结论 热不稳定氨基酸突变和二硫键构建在脱毒酶ZLHY-6改造上具有可行性,ZLHY-6热稳定性的增强提高了其在工业上的应用潜力, 这一结果也为探索酶的计算机辅助手段改造提供策略基础。     

基于定点突变改善中性植酸酶催化特性及结构-效应分析

对前期设计的来源于淀粉液化芽孢杆菌DSM 1061的3 种中性植酸酶突变体（D148E/H149R、Q67E/N68R、D191E）的稳定性及催化效率等进行研究,并对影响其性质的结构因素进行分析。结果表明：与野生酶相比,在85 ℃条件下,突变体D191E半衰期延长了4.3 min,但催化效率下降为野生酶的48.9%;突变体D148E/H149R催化效率为野生酶的229%,半衰期与野生酶基本一致;突变体Q67E/N68R催化效率为野生酶的93%,半衰期延长了0.7 min。圆二色光谱分析结果显示,D148E/H149R催化效率提高最为显著,α-螺旋含量由野生酶中11.79%降至2.90%,无规卷曲含量增加;Q67E/N68R性质与野生酶接近,其二级结构变化最小;D191E催化效率降低,α-螺旋含量增加至24.59%。对野生酶和突变酶的同源模型分析发现,残基D191具有较大的B因子值,不利于酶的热稳定性,各突变残基周围的氢键有所变化。同源模型的分析也将为植酸酶的进一步改良提供理论依据。     

鱼腥藻脂肪氧合酶热稳定性提高的分子动力学模拟

为提高鱼腥藻脂肪氧合酶(Anabaena sp.PCC 7160 lipoxygenase,Ana-LOX)的热稳定性,探索其热稳定性机制。通过同源建模预测了Ana-LOX的三维结构,并通过分子动力学模拟技术手段分别模拟了Ana-LOX于298 K和320 K条件下在水溶液中的运动轨迹,计算均方根偏移与均方根涨落后,以均方根涨落为热稳定性评价指标,结合作用力分析,预测不稳定区域。结果表明:Ana-LOX的T94、I96、A325~Q327区域柔性较大,是导致Ana-LOX热不稳定的关键区域。通过I96V定点突变后,半衰期提高到野生型的2.5倍,验证了原预测结果的有效性,从而为脂肪氧合酶分子的热稳定性改造提供了理论依据。     

基于理性设计提高假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性

对假交替单胞菌JMUZ2的κ-卡拉胶酶进行理性设计,以获得热稳定性提高的突变酶。用PoPMuSiC在线分析工具对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶进行分析,筛选了10 个单点突变体。利用定点突变获得突变酶基因,并对突变酶进行诱导表达、纯化及性质鉴定,筛选出酶比活力不降低且热稳定性提高的突变体K155A。热稳定性分析表明,在50、55 ℃和60 ℃分别处理40 min,突变酶残余酶活力分别是野生型酶的1.8、2.7 倍和4.5 倍。酶的结构及分子动力学模拟分析表明,酶分子疏水相互作用和结构刚性的增强是K155A突变体热稳定性提高的可能原因。通过理性设计获得假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性提高的突变体K155A,对改善酶的性质、扩大κ-卡拉胶酶的应用范围以及κ-卡拉胶酶结构与功能关系研究具有重要意义。     

Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变文库热稳定性提高突变体的筛选及鉴定

利用易错聚合酶链式反应技术引入随机诱变,构建一个Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突变体库。经过筛选,获得一个芳香基硫酸酯酶热稳定性提高的突变株4-153。序列分析表明,该突变体有2个氨基酸替换,包括D84A和H260L。以对硝基苯硫酸钾为底物,突变酶4-153(M4-153)的最适反应温度为55℃,在45、50、55、60℃处理30 min后,M4-153分别保留85%、83%、48%和13%的残留酶活力。野生型酶(WT)在45、50、55、60℃处理30 min后,分别保留79%、68%、21%和1%的残留酶活力。M4-153与WT相比具有更好的热稳定性。M4-153的最适反应pH值为8.0,在pH 5.0~9.0范围内保持稳定。EDTA对突变酶的抑制作用表明,金属离子在突变酶的催化过程中起重要作用。M4-153对一些洗涤剂,包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps,有好的耐受性。M4-153对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为79.5%。     

Enhancing the thermostability of α-glucosidase from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 by single proline substitution

Thermostability can be increased by introducing prolines at suitable sites in target proteins. In this study, we compared five thermostable α-glucosidases and the moderate thermostable α-glucosidase (TtGluA) from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4. Based on the amino acid sequence alignment, four sites (Leu152, Asn208, Lys285, and Thr430) of TtGluA were chosen for proline substitution to improve its thermostability. Thermostability of mutants L152P, K285P, and T430P increased evidently, but no thermostability improvement was observed for N208P. Compared to the wild-type enzyme, T₅₀¹⁵ of T430P had a rise of 2 °C without distinct loss of activity. However, T₅₀¹⁵ values of L152P and K285P increased 2 °C and 10.5 °C, respectively, while retaining activity of only 26.6% and 24.9% of wild-type enzyme. The K_m of L152P, K285P, T430P and wild-type enzyme was 1.61, 0.32, 1.64, and 1.08 mM, respectively. These indicate that the selected sites are not only important for the thermostability but also related to the substrate binding and catalytic activity of TtGluA. The CD spectra analysis of the improved mutants and wild-type enzyme showed no distinct changes in their secondary structures. Combining analysis of secondary structure prediction and 3D structure modeling, the proline substitution at the three sites stabilized TtGluA possibly by reducing the flexibility of loop and random coil or (and) increasing the hydrophobic effect at these strategic regions with no evident structure change.     

嗜热酸性III型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响

对嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL保守基序中非保守氨基酸残基进行定点突变，通过比较TK-PUL与突变体的酶学性质，确定保守基序中关键氨基酸残基对其催化性质的影响。TK-PUL保守基序II中I500W位点变化不影响其最适反应pH值、pH值稳定性、最适反应温度、热稳定性，但使其α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性均明显降低。动力学常数测定结果显示，突变体I500W以麦芽三糖为底物的kcat/Km值基本不变，以异潘糖为底物的kcat/Km值约为TK-PUL的64.78%。结果表明，TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸残基Ile对其水解糖苷键的偏好性起到重要作用。TK-PUL中I500W位点变化不影响其α-1,4-糖苷键水解活性，但使其α-1,6-糖苷键水解活性明显降低。本研究有助于深入理解TK-PUL的双功能催化机制，也可为TK-PUL的分子改造提供理论依据和设计思路。     

新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征

通过定点随机突变技术,提高天冬氨酸代谢途径中首个关键限速酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的催化活力,减弱或解除代谢产物对其协同反馈抑制,并通过Discovery Studio等软件对其空间结构进行分析,借助分子动力学模拟对其机制进行分析.首先选择ATP附近关键残基位点,在前期T379N/A380...     

Purification, characterization, and steady-state kinetics of a meta-cleavage compound hydrolase from Pseudomonas fluorescens IPO1

2-Hydroxy-6-oxo-7-methylocta-2,4-dienoate (6-isopropyl-HODA) hydrolase (CumD), an enzyme of the cumene biodegradation pathway encoded by the cumD gene of Pseudomonas fluorescens IP01, was purified to homogeneity from an overexpressing Escherichia coli strain. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and gel filtration demonstrated that it is a dimeric enzyme with a subunit molecular mass of 32 kDa. The pH optima for activity and stability were 8.0 and 7.0-9.0, respectively. The enzyme exhibited a biphasic Arrhenius plot of catalysis with two characteristic energies of activation with a break point at 20 degrees C. The enzyme has a K(m) of 7.3 microM and a k(cat) of 21 s(-1) for 6-isopropyl-HODA (150 mM phosphate, pH 7.5, 25 degrees C), and its substrate specificity covers larger C6 substituents compared with another monoalkylbenzene hydrolase, TodR Unlike TodF, CumD could slightly hydrolyze 2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoate (6-phenyl-HODA). A mutant enzyme as to a putative active site residue, S103A, had 10(5)-fold lower activity than that of the wild-type enzyme.     

枯草杆菌蛋白酶QK的活性与氨基酸突变位点的相关性

目的:鉴定不同来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的枯草杆菌蛋白酶QK(subtilisin QK)的活性与编码其序列的氨基酸位点突变的相关性。方法:以筛选得到的15株菌株的总DNA为模板,细菌16S rRNA为通用引物,进行PCR扩增,将产物测序后输入NCBI比对,确定其均为枯草芽孢杆菌属。再扩增这15株菌株的QK基因,测序后与GenBank上已提交的QK基因所对应的蛋白序列进行比对,找出氨基酸差异位点。使用纤维蛋白平板法测定菌株所产枯草杆菌蛋白酶的活性,用BCA蛋白测定试剂盒测定发酵液的总蛋白含量,并计算得到单位酶活。结果:根据突变位点的不同把15株菌株分为A、B、C、D四组。A组的突变位点为S184T,单位酶活显著最高(p<0.05);B组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,N365S,C组的突变位点为N193S,S236T,A289V,B、C两组之间单位酶活并无显著性差异(p>0.05),但B、C 两组单位酶活显著小于A组(p<0.05);D组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,A289V,单位酶活显著低于其他三组(p<0.05)。结论:枯草杆菌蛋白酶QK的单位酶活与氨基酸突变位点之间有相关性:S184T和N365S位点变化对单位酶活性有促进作用,A289V位点变化对单位酶活性有抑制作用。据此推测,这些位点位于枯草杆菌蛋白酶QK的活性中心。     

乙酸异戊酯高产菌脂肪酶的特性研究

以乙酸异戊酯高产菌株Loq-c为试验材料,从菌体中提取制备脂肪酶,研究其酶学特性,结果表明：该酶催化反应的最适温度在30 ℃左右,在40 ℃以下具有良好的热稳定性;催化体系的pH在6.0～7.0时,酶的相对活力和稳定性较高,而当pH≤4.0时酶表现得不稳定,酶活力低。金属离子Mg2+和Ca2+能明显促进酶的催化能力,Cu2+和Ag+能明显抑制酶的催化能力,Na+、K+和Zn2+对酶催化的影响不显著。正交试验结果表明,菌株Loq-c脂肪酶最佳酶活条件为：温度在30 ℃,pH值为7.0,Mg2+浓度为5.0 mmol/L。在此最佳条件下,酶活力高达535.8 U/mL。