人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的原核表达及其免疫原性评价

目的原核表达重组人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)A型Long株截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增HRSV截短F1蛋白基因序列,克隆至pET-28b表达载体,构建重组原核表达质粒RSV F1/pET-28b,转化大肠埃希菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;用Ni亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析。将纯化的重组截短F1蛋白免疫ICR小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的截短F1蛋白相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,纯度达90.6%。重组截短F1蛋白免疫小鼠血清抗体效价最高可达1∶4 096。结论原核表达的重组HRSV截短F1蛋白免疫原性好,为单克隆抗体的制备及检测试剂盒的研究奠定了基础。     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达、纯化狂犬病病毒(Rabies virus,RV)核蛋白(Nucleoprotein,NP),并检测其免疫原性。方法 RT-PCR扩增RV CVS-11株NP全长基因序列,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-N,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+柱亲和层析纯化后,进行Western blot分析,并分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平。结果重组原核表达质粒pET-30a-N经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约51 800,表达量约占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RV小鼠血清特异性结合,分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体滴度对数的GMT值(3.81±0.22和3.68±0.20)明显高于阴性对照组(1.25±0.22),且差异均有统计学意义(P<0.01)。结论已成功表达并纯化了RV NP,其免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。     

森林脑炎病毒包膜E蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性初步评价

目的原核表达及纯化森林脑炎病毒(tick-bome encephalitisvirus,TBEV)包膜E蛋白,并初步评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增TBEV E蛋白基因,克隆至载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET-28a-TBEV E,转化感受态E. coli BL21(DE3),挑取阳性克隆,扩增后经终浓度为0. 1 mmol/L的IPTG诱导,表达产物经12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。将鉴定正确的重组蛋白采用镍柱亲和法纯化,铝佐剂吸附后,经小鼠左侧腹腔注射,0. 5 mL/只,间隔1周加强免疫1次,末次免疫后7、14、21、28、35、42、49 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法测定小鼠血清抗体水平。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-TBEV E构建正确。表达产物相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式表达,表达量约22. 3%,且可与小鼠抗TBEV血清发生特异反应,纯化后纯度达90%。末次免疫后21 d,小鼠血清抗体效价达最高,为1∶6 400。结论经原核表达系统成功表达并纯化了TBEV E蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,本实验为TBEV诊断制剂及基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段;重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25%,以包涵体和可溶性两种方式存在;纯化后重组蛋白纯度可达95%以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。     

猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析

目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*,64～223位氨基酸),分别插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A(lOH)3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒G蛋白片段G1及CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达含穿膜肽HIV-TAT与呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段G1及CTL表位的融合蛋白,并进行纯化。方法以质粒pET-G1F/M2为模板,扩增含TAT、RSVG蛋白片段G1和CTL表位F/M2的融合基因片段,与原核表达质粒pET-His连接,构建融合表达质粒pET-TAT-G1F/M2,转化E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达,采用Ni2+螯合亲和层析法纯化经尿素变性的包涵体,梯度透析复性纯化的目的蛋白,并进行Westernblot鉴定。结果在E.coli中可高效表达重组蛋白TAT-G1F/M2,表达量占菌体总蛋白的30%以上,目的蛋白主要存在于包涵体中。经变性、纯化、复性可获得高纯度(>95%)特异性的TAT-G1F/M2蛋白。结论已在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白TAT-G1F/M2,为进一步进行RSV体内体外免疫学研究奠定了基础。     

进化免疫球蛋白结合分子LD5的原核表达、纯化及结合活性

目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。以ELISA和Dot blot对LD5蛋白结合IgG、IgM活性进行鉴定。结果LD5分子在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白相对分子质量为59000。Western blot表明纯化的LD5蛋白能特异结合IgG。ELISA结果显示,LD5在结合IgM上较SpA具有明显的优势。结论LD5分子在大肠杆菌中已成功表达,纯化的LD5蛋白保留了天然Ig结合分子的结合活性。     

东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性

目的表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和CD8+T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P﹤0.01);小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。     

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白的新城疫重组病毒的构建及其免疫原性

目的利用新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传系统构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的重组病毒,并以BALB/c小鼠为动物模型,评价其免疫原性。方法在已建立的NDV反向遗传系统的基础上,将RSV F基因插入NDV全长cDNA克隆中,构建并拯救获得表达RSV F蛋白的重组病毒rLS/RSV-F。采用间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)法鉴定RSV F蛋白的表达;以HA、病毒半数鸡胚感染量(50%infective dose,EID50)、半数组织感染量(50%tissue infectious dose,TCID50)及生长曲线等生物学指标对其生物学特性进行鉴定;将rLS/RSV-F滴鼻免疫BALB/c小鼠,于免疫后第49天经眼眶后静脉丛采血,分离血清,ELISA法检测IgG抗体效价,中和试验检测中和抗体效价。结果成功拯救表达RSV F蛋白的NDV重组病毒rLS/RSV-F,具有与亲本病毒相似的感染能力及生长动力学特性;rLS/RSV-F可刺激小鼠机体产生较高水平的针对RSV F蛋白的特异抗体及RSV中和抗体,与亲本病毒对照组相比,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论成功拯救了表达RSV F蛋白的NDV重组病毒,并通过动物实验证明重组病毒rLS/RSV-F具有较好的免疫原性,为RSV疫苗的研发提供了新思路。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。