抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。     

抗人CD25人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的稳定表达及初步鉴定

目的在CHO细胞中稳定表达抗人CD25人鼠嵌合抗体,并对抗体活性进行初步鉴定。方法采用脂质体法将嵌合抗体真核表达质粒pOptiVEC-H和pcDNA3.3-L共转染CHO-DHFR-细胞,通过去除HT和在培养基中加入500μg/ml的Geneticine进行阳性克隆的筛选,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆,通过在培养基中加入浓度逐步增加的MTX提高克隆的抗体表达量。采用流式细胞术(FCM)检测嵌合抗体的抗原结合活性及人抗体重链Fc段、轻链κ链;提取细胞基因组进行PCR鉴定;抗体经超滤浓缩后,采用蛋白G亲和纯化法进行纯化,并进行Westernblot分析;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,采用ELISA法检测抗体分泌的稳定性。结果获得稳定分泌嵌合抗体的细胞株1C1,ELISA检测抗体表达量为103ng/ml;PCR结果表明,表达的质粒已整合入细胞基因组中;FCM及Westernblot结果显示,嵌合抗体含有人抗体重链Fc段及轻链κ链,且保留了鼠抗体V区的抗原结合特异性;经蛋白G亲和纯化后,获得抗体220μg,纯度>97%;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,抗体分泌保持稳定。结论获得了稳定表达人CD25人鼠嵌合抗体的CHO细胞株,其具有鼠源抗体的抗原结合特异性及人抗体的恒定区。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体在CHO K1细胞中的表达及鉴定

目的 CHO K1细胞中表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体,并进行鉴定。方法采用电穿孔转染法将含编码人源化抗VEGF单克隆抗体轻、重链全基因的真核表达质粒DGV-K11转染至CHO K1细胞,经L-蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide,MSX)加压筛选和有限稀释克隆筛选,获得分泌表达人源化抗VEGF单克隆抗体的K11细胞株。利用生物反应器培养K11细胞,采用MabSelect SuRe、DEAE Sepharose FF和Eshmuno S凝胶色谱纯化培养液,以贝伐珠单抗(Bevacizumab)作为阳性对照,分析人源化抗VEGF单克隆抗体的纯度、电荷异质性、相对分子质量、N-末端序列、等电点及生物学活性。结果人源化抗VEGF单克隆抗体还原和非还原型CE-SDS分析图谱峰形及电荷异质性与阳性对照相似,轻、重链N-末端氨基酸序列一致;人源化抗VEGF单克隆抗体及阳性对照的SEC-HPLC单体纯度分别为97.46%和97.08%,完整相对分子质量分别为149 201.76和149 201.81,主峰等电点分别为7.31和7.32,生物学活性分别为0.993×10~4和0.960×10~4 U/mg。结论于CHO细胞中成功表达了人源化抗VEGF单克隆抗体,与贝伐珠单抗(Bevacizumab)具有相似的纯度、电荷异质性及生物学活性,本实验为CHO细胞大规模表达人源化抗VEGF单克隆抗体奠定了基础。     

抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性

目的构建抗人细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr-细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析。结果嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10%还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgGκ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgGγ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性。结论成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础。     

内部核糖体结合位点介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达

目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC~(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。     

高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。     

抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因在CHO细胞中的表达

目的构建抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因,并在CHO细胞中表达。方法采用RT-PCR及RACE技术从鼠杂交瘤细胞克隆免疫球蛋白可变区基因,与人免疫球蛋白恒区基因拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因,转染CHO细胞并测定其表达量。结果构建的嵌合抗体基因在CHO细胞中的初始表达量为0.71μg/ml,亚克隆后表达量达0.95μg/ml。结论已成功构建抗人TNF-α嵌合抗体基因,并在CHO细胞中得到了高效表达。     

抗人CD4嵌合抗体的稳定表达及鉴定

目的构建抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,并对表达产物进行鉴定。方法采用脂质体法将抗人CD4嵌合抗体质粒pHDC4稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压筛选抗人CD4嵌合抗体稳定表达株,经细胞工厂扩大培养。收集培养上清,经Protein A亲和层析纯化目的抗体,激光共聚焦显微镜观察抗体基因在细胞内的表达,并分别进行质谱分析、蛋白质N-末端测序和平衡解离常数(KD)的测定。结果构建的抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株的抗体表达水平为4.29～10.52μg/ml;BCA测得纯化回收后的抗体表达水平为12.68 mg/L;激光共聚焦检测显示,抗CD4嵌合抗体稳定表达细胞株可稳定表达人的恒定区和鼠的可变区;质谱分析表明,其含有鼠源性和人源性成分;蛋白质N-末端氨基酸测序表明,其轻链与亲本抗体N-末端氨基酸序列完全一致;其KD为2.67×10-9M。结论成功构建了抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,其表达的抗人CD4嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合特异性和亲和力。     

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果　构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论　经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。