SEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析

通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal entero-toxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列sec2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124sec2t,采用"珠磨法"将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10μg/mL Zeomy-cin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-sec2t.Southern blot和Western blot分析表明,sec2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-sec2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-sec2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生;与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.     

莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

双链核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein,DRB)是一类含有双链RNA结合结构域(dsRBD)的蛋白,在小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA或miRNA)的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用.为获得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)中所有CrDRBs的全长序列并进行生物信息学分析,从蛋白质功能结构域Pfam数据库中下载了dsRBD结构域模块,使用HMMER软件基于dsRBD检索C. reinhardtii全基因组序列,获得C. reinhardtii中4个含dsRBD结构域的CrDRB蛋白相关信息.抽提C. reinhardtii总RNA,反转录获得其cDNA,设计相应引物克隆获得其完整的基因ORF序列.设计实时荧光定量PCR引物,以actin基因为内参,分析C. reinhardtii各CrDRBs基因的相对表达.同源比对分析C. reinhardtii各CrDRBs蛋白的dsRBD序列.通过Phyre2软件在线预测其dsRBD的高级结构.将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析,初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性.本研究共获得了4个莱茵衣藻双链RNA结合蛋白,均具有典型的dsRBD结构域,含有3个保守氨基酸.相比已报道的DUS16,其他3个CrDRBs的CDS序列较长,基因表达较高(除CrDRB2外).本研究为下一步揭示莱茵衣藻CrDRB在miRNA调控途径的功能奠定基础.     

选择标记基因在衣藻叶绿体中的表达

利用基因枪法将带有码壮观酶素抗性基因aadA的衣藻叶绿体表达载体p64D导入到衣藻受体细胞中,经壮观酶素抗性筛选后,获得了转化子,表明基因aadA已经在衣藻细胞中获得了表达.进一步经PCR检测和酶切Southern杂交证实,外源基因aadA已经整合到衣藻叶绿体基因组的特定位点中了.     

莱茵衣藻响应缺硫的环状RNA的预测与鉴定

环状核糖核酸(circular ribonucleic acid,circular RNA或circRNA)是一类无5'帽子结构及3'poly A尾,以共价键连接形成闭合环形结构的非编码RNA分子,通过转录后调控的方式参与动植物细胞的众多代谢途径.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)是一种重要的真核单细胞模式微藻,为探究其是否存在环状RNA,本研究通过RNA-Seq高通量测序分析正常与缺硫培养的C. reinhardtii RNA组学数据,首次预测获得218条环状RNA序列,通过对比缺硫处理前后莱茵衣藻环状RNA序列,获得8条差异表达的环状RNA序列(其中,5条为表达上调、3条为表达下调).本研究首次对单细胞真核微藻莱茵衣藻进行环状RNA的生物信息学预测,确认莱茵衣藻环状RNA响应缺硫胁迫,为下一步揭示莱茵衣藻环状RNA参与响应莱茵衣藻缺硫的作用机制奠定基础.     

莱茵衣藻硫胁迫相关microRNA检测及其靶基因分析

采用特异反转录引物,构建莱茵衣藻microRNA(miRNA)的cDNA文库.选用U4核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)作为内参,用SYBR(R)green RT-PCR对3种与莱茵衣藻缺硫胁迫反应相关的miRNA进行检测,利用在线平台软件Web MicroRNAs Designer(WMD3)对miRNA靶基因进行预测.结果表明,在缺硫胁迫下,3种miRNA(miRNA1145.2、miRNA1146和miRNA1158)的表达水平均明显上调,与正常培养的莱茵衣藻表达miRNA的相对丰度比值分别为3.11、2.38和3.67.靶基因预测分析表明,miRNA1145.2能影响脂肪酸氧化反应,miRNA1146与辅酶Q代谢相关,miRNA1158可能参与磷酸戊糖途径调控.     

农杆菌介导法获得抗病毒病转基因大白菜

为获得抗芜菁花叶病毒病的大白菜植株,用携带TuMV-cp基因的农杆菌R1000和EHA105转化大白菜子叶和下胚轴,PCR、PCR-Southern检测证实TuMV-cp基因已导入并整合到大白菜的基因组中.RT-PCR检测表明TuMV-cp在转录水平上获得了稳定表达.TuMV-cp基因在转基因植株T1代中获得了稳定的遗传.抗病性鉴定结果表明转基因植株T1代较非转基因植株对TuMV的抗性增强,获得了抗病毒病的转基因大白菜植株.     

植酸酶基因在海水小球藻细胞内的表达

为建立海水小球藻外源基因转化系统,使外源植酸酶基因在海水小球藻细胞内获得稳定表达,利用电激法将植酸酶基因与海水小球藻细胞共转化;利用含G418的抗性平板筛选抗性藻株,并对所获得的抗性藻株依次进行PCR检测、Southern杂交分析和植酸酶活性与性质的检测.经过转化处理的微藻细胞在含G418的抗性平板上培养3周后,每个平板有10~30个抗性藻株长出;在这些抗性藻株中,PCR检测的阳性率为40.16%;Southern杂交分析和植酸酶活性检测证明,植酸酶外源基因已经在小球藻细胞中获得正确表达.植酸酶外源基因在海水小球藻细胞内被成功表达.     

氮受控对酒糟废水-微藻培育耦合体系的影响

为考察酒糟废水-微藻培育耦合体系的最适氮营养条件,运用室内受控实验,调控酒糟废水总氮浓度,考察莱茵衣藻、二形栅藻分别在单一培养和共培养条件下的生长特性,计算酒糟废水中营养盐的去除率.研究结果显示,较之二形栅藻,莱茵衣藻对氮的需求更为敏感.当初始氮磷质量比为2.45,且初始总氮(total nitrogen,TN)质量浓度为40.25 mg/L时,对莱茵衣藻,最终生物量为879.50 mg/L,藻蛋白质量浓度达69.00 mg/L,对总氮、总磷(total phosphorus,TP)和化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)的去除率分别为93.68%、90.81%和72.57%;对二形栅藻,最终生物量为775.00 mg/L,藻蛋白质量浓度为154.53 mg/L,对TN、TP和COD的去除率分别为96.85%、70.80%和82.06%.共培养条件下,莱茵衣藻在生长和对氮磷等资源的利用方面受二形栅藻的抑制影响较明显,当初始氮磷质量比为2.45,初始TN质量浓度为40.25 mg/L时,莱茵衣藻对TN和TP的去除率分别为97.37%%和74.74%;共培养条件下微藻对酒糟废水COD的去除结果与二形栅藻类似.研究发现,利用酒糟废水-微藻培育耦合体系、单一培养体系和共培养体系,酒糟废水水质均能满足地表水环境质量标准的IV类水总氮(≤1.5 mg/L)和发酵酒精与白酒工业水污染物排放标准的要求.     

5种绿藻对几种常用抗生素的敏感性

考察莱茵衣藻、亚心形扁藻、四爿藻、微绿球藻和小球藻5种绿藻对几种常用抗生素的敏感性,结果表明,莱茵衣藻对卡那霉素、四环素敏感,敏感浓度(细胞致死浓度,下同)均为25μg/mL,对氯霉素敏感性次之,而对氨苄青霉素不敏感;亚心形扁藻和四爿藻对氯霉素敏感,敏感浓度均为25μg/mL,对四环素、卡那霉素和氨苄青霉素不表现敏感性;小球藻和微绿球藻对实验中的4种抗生素都不敏感。     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对里氏木霉产纤维素酶的影响

为探究脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化修饰对丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)产纤维素酶基因表达的表观遗传调控机制,利用不同浓度(0~1.0 mmol/L)的化学修饰剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza)培养T.reesei QM9414.通过测定滤纸酶活性(filter paper enzymatic activities,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities,CMCA)确定纤维素酶活性的变化;利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测0.1 mmol/L 5'-Aza培养的T.reesei QM9414中纤维素酶基因cbh1、egl1、酶激活因子xyr1基因以及分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的表达水平;通过甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)分析cre1、ace1、cbh1、egl1和xyr1基因上游序列的甲基化状态;利用Western blot和DNA甲基化定量测定分析了DNA甲基转移酶和DNA的甲基化水平.结果显示,0.1mmol/L 5'-Aza处理后的T.reesei QM9414菌株的FPA和CMCA最高,比出发菌株T.reesei QM9414分别高30%和53%;RT-q PCR结果显示,处理后的T.reesei QM9414菌株中纤维素酶基因cbh1、egl1与酶激活因子xyr1基因的相对表达量均高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1和ace1基因的相对表达量与出发菌株无明显差异;MS-PCR结果显示,cbh1、egl1和xyr1基因的非甲基化状态高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的非甲基化状态也无明显差异;Western blot和DNA甲基化定量测定结果分别显示,5'-Aza处理后菌株的DNA甲基转移酶表达比出发菌株明显降低,全基因组DNA甲基化程度也有下降.研究结果表明,5'-Aza处理T.reesei QM9414菌株后,纤维素酶活性明显增加,纤维素酶基因cbh1、egl1和激活因子xyr1基因表达水平的增加可能是通过DNA甲基转移酶影响DNA甲基化水平,最终调控基因的表达.     

莱茵衣藻对MeJA处理的初期响应模式分析

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）是植物次生代谢的调节剂,参与异戊二烯代谢调控,对莱茵衣藻的异戊二烯类物质合成有重要影响．为探究莱茵衣藻如何快速响应MeJA处理,测定MeJA处理下莱茵衣藻的生长状态和光合效率等生理特征参数,重点关注MeJA处理24 h内2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methnatureyl-D-rythritol-4-phosphate,MEP）合成途径、类胡萝卜素合成途径和甾醇合成途径关键基因的表达水平变化．结果表明,MeJA处理降低了莱茵衣藻的生物量积累和光合活性,上调了MEP通路和甾醇合成通路相关基因,下调了类胡萝卜素合成途径的关键基因．在转录与生理层面,莱茵衣藻对于MeJA处理的初期响应具有快速与剂量依赖性的特点．研究结果为探索微藻类异戊二烯合成和代谢机制提供理论参考．     

5种绿藻对几种常用抗生素的敏感性

考察莱茵衣藻、亚心形扁藻、四爿藻、微绿球藻和小球藻5种绿藻对几种常用抗生素的敏感性，结果表明，莱茵衣藻对卡那霉素、四环素敏感，敏感浓度(细胞致死浓度，下同)均为25μg／mL，对氯霉素敏感性次之，而对氨苄青霉素不敏感；亚心形扁藻和四爿藻对氯霉素敏感，敏感浓度均为25μg／mL，对四环素、卡那霉素和氨苄青霉素不表现敏感性；小球藻和微绿球藻对实验中的4种抗生素都不敏感。     

丹参SmWRKY65基因的克隆及其拟南芥遗传转化

为研究丹参WRKY家族基因的生物学特性,通过生物信息学的方法从丹参转录组库中筛选出响应茉莉酸甲酯(MeJA)的SmWRKY65,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测该基因的组织器官表达特性,进而采用花序浸泡法把基因导入到拟南芥中。研究表明SmWRKY65基因编码区的长度为867bp,编码288个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域和1个C_2H_2锌指结构域,属于WRKY转录因子家族第IIa类成员。SmWRKY65在根、茎、叶、花等组织器官中均有表达,且在叶和茎中的表达量最高,5月份和10月份各个组织器官中表达也存在差异。最后获得了转基因拟南芥株系。     

集胞藻ApcA和CpcA的体内生物重组研究

利用聚合酶链式反应(PCR)克隆出集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803变藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基的编码基因apcA和cpcA,将脱辅基蛋白ApcA、CpcA分别与裂合酶CpeS1或CpcE/F以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达。研究表明:通过大肠杆菌体内重组可以获得具有光学活性的重组色素蛋白PCB-ApcA和PCB-CpcA。吸收光谱、荧光光谱以及锌电泳均表明,藻蓝胆素与脱辅基蛋白形成了正确的共价连接。由此可知,利用大肠杆菌进行集胞藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白α亚基的体内生物合成是可实现的。同时还对重组色素蛋白的摩尔消光系数和荧光量子产率进行了计算。     

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度为20~24核苷酸(nucleotide,nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),在植物生长发育过程中具有重要作用.为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子,利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系,通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体.对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和全基因组测序实验.结果显示,突变的基因为Ago1(Argonaute 1),该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白,成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控.验证了该筛选体系的可行性.通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA活性或miRNA运输等通路的因子,为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础.     

诱导条件下雨生红球藻虾青素合成相关基因的表达特征分析

用脱落酸(ABA)和氮饥饿加高光诱导雨生红球藻,研究在胁迫条件下虾青素在细胞内积累的变化以及虾青素合成基因的表达模式。结果表明,在诱导条件下雨生红球藻细胞内虾青素积累明显。半定量RT-PCR结果表明,在虾青素合成酶系基因中八氢番茄红素合成酶基因(psy)、八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)在诱导一段时间内mRNA水平一直在升高,在诱导后期mRNA依然具较高水平,胡萝卜素羟化酶基因(crtR-B)、胡萝卜素酮化酶基因(bkt)在诱导一段一段时间后mRNA水平升高后又略有下降,而番茄红素环化酶基因(lcy)则不受这些诱导条件的调控,一直处于较高水平的表达。虾青素合成基因表达模式的差异表明这些基因分子调控机制的差异。     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

雨生红球藻4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸还原酶基因(HDR)的克隆及表达分析

在缺氮、高光条件下,雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)体由生长状态变为休眠状态,并形成厚壁孢子,同时在细胞内产生大量虾青素。4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸还原酶(HDR)是甲基赤藓糖磷酸(MEP)途径中的最后一个酶,催化4-羟基-3-甲基-(2E)-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸(IPP),而IPP合成途径是叶绿素和类胡萝卜素合成的上游途径。本研究根据雨生红球藻的转录组中获得的HDR基因的部分序列设计引物,通过RACE的方法获得雨生红球藻的HDR基因全长序列,命名为HpHDR。生物信息学分析结果表明:HpHDR长1 421bp,编码434个氨基酸,属于LYTB蛋白质家族,其氨基酸的相似性与其它绿藻植物超过90%。通过实时定量RT-PCR方法分析了在缺氮、高光及高光缺氮胁迫条件下雨生红球藻中HDR基因表达调控模式,结果显示:在3种诱导条件下,HDR基因均存在转录上调,但是表达模式不同。在缺氮(-N)条件下,HDR基因在22d表达量最大,为正常条件下的18.0倍;在高光(HL)条件下,HDR基因在第7d的最大表达量为正常条件下的22.3倍;在高光-缺氮(HL-N)条件下,HDR基因在第2d达到最大表达量,为正常条件下的54.4倍。研究结果表明HDR基因的表达量与雨生红球藻在缺氮、高光、高光缺氮条件下色素合成量之间存在正相关性。     

念珠藻Fe-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据低等物种Fe-SOD核酸序列设计简并引物，以念珠藻基因组为模板，扩增获得了念珠藻Fe-SOD基因.将此基因重组至原核表达载体pET22b（＋），构建成工程菌pET-SOD，并转化至大肠杆菌宿主.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得Fe-SOD蛋白分子量约为28 kD，占全菌蛋白的78％，并以包涵体形式表达.经Ni2＋亲和层析柱纯化后，目的蛋白的SOD比活力达1 100 U/mg，在紫外可见光谱中表现出金属Fe的特征峰.肿瘤细胞共培养试验表明，此Fe-SOD具有一定的抗SPC-A-1肺腺癌细胞增殖的能力.